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痴梦潇湘

木虫 (著名写手)

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[交流] J. Med. Chem. 2012年报道的三个新靶点（UT、PfNDH2、ApoE4）已有10人参与

J. Med. Chem.报道的新靶点一般具有较好的成药性，经常引发后10年的研究热潮，当然也不乏默默无名的。下面是两个今年报道的新靶点，不知道前景怎么样，有人在做或计划做吗？如果有遗漏，欢迎补充，一定要是第一次出现在JMC中才算。

尿素通道蛋白阻断剂
尿素通道蛋白（urea transporter, UT）分布于肾小管上皮细胞和肾小血管内皮细胞，通过逆流倍增与交换机制，浓缩尿液。肾小管表达UT-As（UT-A1, UT-A2, UT-A3），由SLc14A2基因编码，而肾小血管表达UT-B，由SLc14A1基因编码。UT-B或UT-As敲除小鼠尿液浓缩能力降低，这为开发新型利尿药——UT抑制剂提供了依据。传统的利尿药通过靶向盐转运体发挥作用，对体液潴留性疾病如晚期充血性心脏衰竭、肝硬化等作用有限。

California大学研究人员通过高通量筛选100,000个化合物得到1，能竞争性抑制UT-B，并对UT-As具有选择性。但化合物1极易代谢，半衰期为2.8min，LC/MS显示代谢产物为m/z=472、m/z=488（羟基化），将苄位用氟原子封闭，得到化合物2，半衰期延长至120min。动物实验显示，该抑制剂能降低尿液渗透压，但对TU-B基因敲除小鼠无效。

Reference: J. Med. Chem. 2012, 55, 5942-5950.
国内北大药理学系副主任杨宝学在做，也是该领域的国际权威。

恶性疟原虫泛醌氧化还原酶抑制剂
随着抗疟药物如氯喹耐药性的产生，全球疟疾的死亡率升高，每年大约有100万疟疾患者死亡，开发新型抗疟药物迫在眉睫。恶性疟原虫泛醌氧化还原酶（PfNDH2）是电子传递链的主要电子供体，有成为抗疟靶点的潜力。

Liverpool大学的研究人员联合化学信息学方法，高通量筛选了17000个化合物（来自商业化合物库，含75000个化合物），发现12种不同的化合物骨架，选择活性最高的喹诺酮作为先导物（化合物2），设计合成一系列衍生物，经构效关系分析优化得CK-2-68，该化合物具有较高活性，半衰期为226min，清除率为0.76 ml/min/kg。为了降低CK-2-68的cLogP值，增加溶解度，引入杂环代替苯环，得到化合物SL-2-25，该化合物的半衰期594min。

Reference: (a) J. Med. Chem. 2012, 55, 1831-1843; (b) J. Med. Chem. 2012, 55, 1844-1857; (c) J. Med. Chem. 2012, 55, 3144-3154.

[ Last edited by 痴梦潇湘 on 2013-1-4 at 19:50 ]

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1楼2012-12-16 17:36:06

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痴梦潇湘

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痴梦潇湘: 回帖置顶 2013-01-04 19:49:39

ApoE4这个靶点的第一个小分子调节剂前几年就已经申请专利了，只是直到最近才公开发表。这个课题组做ApoE研究已有20年历史，连续在JBC、PNAS上刊登相关论文，Merck好像对这个课题组很有兴趣。JMC上没有原始研究，只有一篇综述，不过这个靶点火起来的可能性非常大，毕竟β-分泌酶、γ-分泌酶临床研究连续受挫的情况下，作用明确的新靶点非常值得一试。通过图4可以看到，ApoE4对神经元的生长有非常明显的作用。

ApoE的结构特征
ApoE是一种胆固醇诱导的载脂蛋白（Apoprotein），作为脂转运蛋白存在于血液和组织液中，能够重分配胆固醇和磷脂供细胞代谢或修复生物膜。ApoE是由299个氨基酸构成的蛋白（34kDa），有三种亚型（ApoE2、ApoE3、ApoE4）。三种亚型互相组合形成六种表型（三个杂合子、三个纯合子）：ApoE2/2、ApoE3/3、ApoE4/4、ApoE2/3、ApoE2/4、ApoE3/4。三种亚型的不同之处在于112位和158位残基，ApoE2为Cys112/Cys158，ApoE3为Cys112/Arg158，ApoE4为Arg112/Arg158。
ApoE主要由肝细胞合成，进入血液形成脂蛋白颗粒（极低密度脂蛋白、乳糜微粒、高密度脂蛋白），在血浆中的浓度为40-70 μg/mL。第二个合成部位是大脑，主要由星形胶质细胞（astrocyte）合成，受损的神经元也会合成少量ApoE。神经元损伤诱导ApoE的合成，以便转运胆固醇和其他脂质，用于膜修复。另外全身的巨噬细胞（macrophage）、大脑中的小胶质细胞（microglia），也能合成ApoE。脑脊液（cerebrospinal fluid）中，ApoE是主要的脂转运蛋白，与HDL样颗粒和小磷脂颗粒（small phospholipid disk）有关。
ApoE是LDL受体相关蛋白的主要配体，含有两个结构域，N端与LDL受体结合，C端与脂质结合，中间由铰链连接。LDL受体结合区是N端的134-150位氨基酸残基，这一区域富含精氨酸和赖氨酸（碱性）。ApoE3、ApoE4都能与受体结合，而ApoE2与受体结合不好，与III型高脂蛋白血症有关。脂质结合区是C端的244-272位氨基酸残基（推测形成α-螺旋），ApoE2、ApoE2倾向于小的富含磷脂的HDL，ApoE4倾向于大的甘油三酯。
X-ray晶体结构揭示了ApoE3与ApoE4关键氨基酸残基的不同取向（J. Biol. Chem. 1994 , 269, 22358-22365），ApoE4的Arg61能够与Glu255相互作用，而ApoE3不能。ApoE4的Arg61或Glu255变异，可以将其转变为ApoE3样构象，消除ApoE4的有害作用。ApoE2、ApoE3没有这种结构域之间的相互作用（domain interaction），呈现一种比较开阔的结构。另外，在生理状态下，三种亚型的稳定性也有差异（ApoE2>ApoE3>ApoE4）。ApoE4的结构域相互作用和不稳定性，与多种神经系统疾病有关，阻断结构域相互作用，可以消除其有害作用。

ApoE4与Alzheimer’s disease的关系
ApoE4通过两方面影响Alzheimer’s disease：（1）增加患病风险；（2）提前患病年龄，含单个ApoE4等位基因，患病提前7-8年，含一对ApoE4等位基因，患病提前15-16年。65%-80%的AD病人至少含有一个ApoE4等位基因，相反普通人群只有25%是ApoE4携带者。有文献报道，ApoE4的表达会阻碍淀粉样蛋白（Aβ）的清除（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2011, 108, 4236-4241），增加Aβ的合成（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2005, 102, 18700-18705）。
正常情况下，细胞合成ApoE后经内质网-高尔基体转运，分泌到细胞外。由于ApoE4的结构域相互作用，形成异常构象，可能被蛋白酶误解切割，产生有神经毒性的碎片，脱离转运通路，进入细胞质中。这些碎片的有害作用包括：（1）损害神经元线粒体功能：改变线粒体膜电位，降低线粒体电子传递酶活性（如线粒体细胞色素C氧化酶（mtCOX1）和ATP合成酶活性35-40%）；（2）降低神经元线粒体运动能力（neuronal mitochondrial motility）；（3）阻碍突触生成（synaptogenesis），降低突触连接（synaptic spine）的密度；（4）损害细胞骨架：摧毁微管、Tau蛋白磷酸化、神经纤维缠结；（5）中枢神经系统疾病：海马GABA能中间神经元缺失；损害学习和记忆功能。

ApoE4结构校正剂（ApoE4 structure correctors, ApoE4SC）
Yadong Huang等人筛选了ChemBridge library，发现先导化合物CB9032258，与ApoE4结合后，能阻断ApoE4的结构域相互作用，增加mtCOX1水平。随后与Merck Research Laboratories合作，发现一系列ApoE4SC（PH-001、PH-002活性较好）。
图1. ApoE4结构校正剂

图2. 荧光共振能量转移分析（FRET assay）：绿色荧光蛋白（GFP）作为荧光供体，融合在ApoE的N端，大肠杆菌二氢叶酸还原酶（eDHFR）融合在AopE的C端，形成GFP-ApoE-DHFR，将它表达在Neuro-2a细胞上。加入eDHFR高亲和力的配体甲氧苄胺嘧啶（TMP），并且与六氯-6-甲基荧光素（HEX）共轭，对位荧光受体。当GFP与TMP-HEX的距离在7-10 nm时，GFP会激发TMP-HEX发出565nm荧光。GFP-ApoE4-eDHFR的荧光强度要高，因为有结构域相互作用，使得N端和C端互相靠近。当给予化合物CB9032258时，GFP-ApoE4-eDHFR的荧光强度显著下降，而GFP-ApoE3-eDHFR基本不变。

图3. mtCOX1水平分析：表达ApoE3与ApoE4-R61T（61位氨基酸残基变异，不能产生结构域相互作用）的Neuro-2a细胞中mtCOX1水平与对照细胞相似，而表达ApoE4的Neuro-2a细胞中mtCOX1水平显著下降。当给予化合物CB9032258后，表达ApoE4的细胞中mtCOX1水平显著增加，而表达ApoE3和ApoE4-R61T的细胞维持不变。

图4. ApoE4对神经元生长的影响：表达ApoE4的Neuro-2a细胞基本没有长突触，而表达ApoE3和ApoE4-R61T的细胞都能长出长突触。当给予化合物PH-002后，表达ApoE4的细胞也能长出长突触。

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