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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 简单HE认真 at 2012-12-01 21:21:27
没这麽简单吧,我们实验室重生过的镍柱基本都不怎么好用的,而且我的柱子就用过一次,这样就重生也太不实用了吧,又不经济,呵呵!...

只用过一次就变白是不怎么正常,如果纯化同一蛋白通常只是洗一曦反复用很多次的。你确定不是用了什么不正确的溶液?
11楼2012-12-02 03:29:33
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简单HE认真

木虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by jiangyhai at 2012-12-01 22:57:40
你的溶液中是不是EDTA之类的螯合剂?...

没有的啊,就是8MU,磷酸盐,Tris-Hcl,没有EDTA的。
简单做人,认真做事。
12楼2012-12-02 18:08:48
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xiaoxia110

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你是纯化包涵体吧?应该加了些还原剂吧?是不是加了DTT?
13楼2012-12-02 20:45:58
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linzshit

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
貌似9楼正解,很有可能是被螯合下来了
14楼2012-12-03 10:24:59
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qusongyuan

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-12-03 16:38:02
用EDTA确实可以将镍柱洗掉,很少即可。你的溶液中8M尿素及tris·cl,磷酸盐缓冲液没有问题的话,是不会洗掉Ni2+的。另外SDS似乎是不能洗掉Ni2+的,这点需要证实,本人做过似乎没事。可能你用的是TE缓冲液,TE里面的E是EDTA啊!!!!!!T是tris·cl。挂柱的步骤较多,这里不写了,如有需要请联系我。
15楼2012-12-03 12:49:37
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lixin123qq

木虫 (小有名气)

小小博士

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-03 16:38:10
15喽分析的有道理, 你的方法洗过柱子后 ,需要用硫酸镍溶液(浓度一般为100mM,绿色溶液),重新冲洗 ,挂镍,直到流川里变成浅绿色溶液。然后再拿dd水冲洗才能再用,然后用你的上样buffer,平衡,再上样。
16楼2012-12-03 14:17:36
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CharityZhou

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

这种情况我遇到过啊,说明书也会有的,你的镍离子被螯合掉 了,加点硫酸镍溶液啊,这样才能重生的。
生命不息,战斗不止
17楼2012-12-04 10:09:42
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Dearstar

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我们一般是用2-3次就再生的啊,同意再生重新加Ni试试看,没事的~~
18楼2012-12-24 11:08:31
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atai5793

新虫 (初入文坛)

你问题解决了没有 我是用氢氧化钠浸泡 也是变白 不知道怎么回事?
19楼2013-01-05 21:14:31
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yongbo_liang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

多数是由于你的样品溶液中含有螯和金属离子的试剂,导致Ni离子流失了。
如果你想简单的话,就可以直接,溶解点NiSO4,过次柱子,再用水清洗就可以用了。
(正常应该先将填料上可能有的Ni螯和掉,清洗一下填料,然后重新上ni溶液就行了)
20楼2013-01-06 10:38:10
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