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猕猴桃果水溶性多糖硫酸酯的合成
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多糖在医药上作为免疫调节剂用来治疗疾病已被人们所接受。近年来还发现多糖的衍生物，尤其是硫酸酯化多糖具有独特的作用，如抗凝血、抗病毒、抗肿瘤、抗艾滋病毒等。对多糖进行化学或物理改性的研究，为多糖的应用提供了更多的可能[1]。 多糖硫酸酯是多糖大分子链中单糖分子链上的某种经基被硫酸根所取代而形成的一类化学结构复杂、生物活性多样、构效关系鲜明的多糖衍生物。近年来不断发现硫酸酯化多糖具有多种生物活性，如:增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒等，使硫酸酯化多糖的研究成为多糖研究领域内的一个新热点。 猕猴桃属于猕猴桃科猕猴桃属,落叶性藤本果树,简称猕猴桃. 世界上约有56 种,中国约有52种,其中猕猴桃是该属植物中果实最大、经济价值最高的一种,中国大部分地区均有栽培[2]. 唐代的《本草拾遗》中说:“猕猴桃甘酸无毒,可供药用. 主治骨节风、瘫痪不遂、长年白发、痔病等”。 猕猴桃果实营养丰富，素有Vc之王的美称[3]。现代药理活性实验也表明,猕猴桃的果实、根、茎等含多种有效药用组分[4],尤其是猕猴桃多糖,其含量约为8－17％，因其能阻断亚硝酸类化合物合成，刺激或提高机体免疫功能、激活或提高巨噬细胞的吞噬能力,具有一定的抗癌作用[5],而引起人的广泛关注。 关于多糖的硫酸酯化，相关报道多为香菇，地衣等，而国内外对于猕猴桃果中水溶性多糖的研究相对很少，本文研究用猕猴桃果水溶性多糖制备硫酸酯[6]。 1材料与方法 1.1仪器与试剂 离心机、搅拌器、7521分光光度计、触点温度计、1/1000分析天平 猕猴桃果水溶性多糖(自制)，氯磺酸、吡啶、二甲基亚砜、乙醇、丙酮均为分析纯。 1.2实验方法 1.2.1水溶性猕猴桃果多糖的硫酸酯化 ①硫酸酯化试剂制备: 将氯磺酸滴加入吡啶中，物料比分别按1/2， 1/3，1/4进行混合。滴加时要注意搅拌的速度，以防生成物结块，同时也要控制一定的滴加速度，过快时会因放热造成反应的温度难以控制。最好在0℃以下进行，反应容器要密封性良好。 ②多糖硫酸酯化反应: 以反应时间、反应温度、氯磺酸与吡啶的摩尔比值作为三个因素，分别以三个不同的水平进行正交设计实验，优化硫酸酯化的合成条件。 精确称取一定量的水溶性多糖，加20mL二甲基亚砜预溶，冰水浴下搅拌20min，加硫酸酯化试剂(7－12mL)30－60℃反应2－4h，反应完毕后撤去热源，冰水浴冷却至0℃以下，再加入20％的NaOH溶液调pH值至7.0－8.0，加水至总体积为120mL，把样品转移至透析袋（截留分子量为60kDa）中，对自来水流水透析72h，再对去离子水透析36h，减压浓缩，乙醇沉、丙酮洗，干燥，待用。 1.2.2磺酸基含量的分析 ①标准曲线的制备 精密称取硫酸钾0.181g，加水适量使其溶解，转移到100mL容量瓶，定容， 则得1 mmol/mL的SO42－溶液。分别吸取2, 4, 6, 8, l0 mL溶液，转入100mL容量瓶中，定容，分别吸取5mL，置于50mL比色管中，加5mL25 ％ BaC12，摇匀，放置10min，用7521分光光度计在400nm处测定吸光度，以SO42－浓度(X)和吸光度(Y)做线性回归方程，得到标准曲线。 ②样品溶液的制备 精密称取样品20mg，加入20％盐酸20mL，电炉上煮沸至溶液澄清，稍怜， 转入100mL容量瓶中，定容，吸取5mL，置于50mL比色管中，加入5mL25 ％ BaCl2摇匀，制成样品溶液。用7521分光光度计在400nm测定样品的吸光度，根据标准曲线，计算所得样品的取代度。其计算公式为： 取代度(DS)=(1.62×S％)/(32－1.02×S％)。 式中，S％表示SO42－的百分含量。 2 结果与讨论 2.1磺酸基含量的标准曲线 图1 磺酸基含量的标准曲线 Fig1 Standard curve of contents of SO42－ 得标准曲线Y=0.9883x + 0.0007,相关系数R2=0.9987，可见曲线的相关性良好。 2.2硫酸酯化反应条件的确定 由取代度的公式DS=(1.62×S％)/(32－1.02×S％)，可看出，取代度和取代基（即磺酸基）的百分含量成增函数关系，因此，考查反应诸因素对取代度的影响时，可以通过考查各反应因素对取代基含量的影响来进行，其变化趋势一样。 2.2.1氯磺酸与吡啶的摩尔比对硫酸酯化反应取代度的影响 固定反应时间为3h,反应温度为45℃，改变氯磺酸与吡啶的摩尔比，以考查不同的酯化剂中氯磺酸与吡啶的摩尔比对产物取代度的影响。结果见图2。 从图2可知，产物的取代度随酯化剂中氯磺酸含量的增加而上升，且在1/2与1/3的比值之间增幅比较明显。随着氯磺酸比例的提高，氯磺酸一吡啶盐(淡黄色固体)生成增多,甚至出现板结，搅拌困难;另一方面,高比例的磺化试剂，多糖易酯化,取代度高，但产率低，原因可能是由于反应液酸度过高(pH ＜ 1),从而引起多糖的降解。 2.2.2反应时间对硫酸酯化反应取代度的影响 固定氯磺酸与吡啶的摩尔比为1：3，反应温度为45℃，改变酯化反应时间，以考查时间因素对产物取代度的影响。结果见图3。 从图3可以知道，在酯化反应中，随着反应时间的延长取代度也明显提高，但取代度的提高与反应时间的延长并非成线性的关系，当反应时间到达一定值时，产物的取代度也就开始下降。 .2.3反应温度对硫酸酯化反应取代度的影响 固定氯磺酸与吡啶的摩尔比为1：3，反应时间为3h，改变酯化反应温度因素，以考查反应温度对产物取代度的影响。结果见图4。 从图4可看出，在30～45℃之间，随着反应温度的提高，酯化产物的取代度明显地升高，但当反应达到40℃其增长的速率就略有减缓的趋势。实验表明，高温(100℃)条件下，反应结束经3, 5－二硝基水杨酸比色法测得还原糖含量较高，因此本实验将温度定在45℃。 2.2.4硫酸酯化反应条件的确定 猕猴桃果水溶性多糖硫酸酯化结果见表1: 表1 正交实验结果 Table1 Result of orthogonal experimental of each group 实验号 氯磺酸:吡啶 反应时间 经综合比较－直观分析，对取代度来说，影响因素从大到小为:反应温度＞酯化剂量加入量＞反应时间；为得到较高的取代度，较佳的工艺条件是:反应温度45℃，反应时酯化试剂量的加入量的配比为1：2，对反应时间来说，其水平和均值都是0.50，似乎反应时间选3h和选4h是一样的，但从图3可以看出，酯化反应超过为4h，取代度有下降的趋势，因此最佳反应时间为3h。 3.结论 在正交实验中，分别比较了硫酸酯化反应中酯化剂用量、反应时间、反应温度对反应产物取代度的影响，并根据正交实验的结果选择了最优的反应条件:反应温度45℃，反应时加入酯化剂量的配比为l: 2，反应时间为3h。 参考文献 [1]刘美琴，灵芝多糖的研究进展[J].微生物学通报，1998，25（3）:173－175. [2]刘成梅,游海.天然产物有效成分的分离与应用[M].北京:化学工业出版社,2003.242-248. [3]方积年.多糖的研究现状[J].药学学报，1986,21(12):944－950. [4]阎家麒,王九一,赵敏. 猕猴桃多糖的提取及其对自由基的清除作用[J].中国生化药物杂志,1995 ,16 (1):12－14. [5]张力田.碳水化合物化学[M].轻工业出版社，1988. [6]方一苇.具有药理活性多糖的研究现状[J].分析化学,1994,22(9):955－960. |
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2楼2007-07-08 22:54:13