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玉米黄色素的酶法提取工艺优化
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玉米蛋白粉(Corn Gluten Meal, CGM)中总蛋白质含量为65％左右，还含有丰富的类胡萝卜素，包括玉米黄素、β－胡萝卜素、叶黄素、α－胡萝卜素、新黄质及金莲花黄素等成分，含量为200－400ug/ g[1]。玉米黄色素除了可作为食品着色剂外，还具有不可多得的营养保健功效，例如可降低患老年性眼部黄斑退化、老年性失明、老年性白内障的风险，抑制肿瘤的生长，减缓动脉硬化的进程等[2,3]。 目前，从玉米蛋白粉中提取玉米黄色素的方法主要是浸提法，提取溶剂采用70％－95％的乙醇，浓缩后得到玉米黄色素粗制品。但是由于玉米蛋白粉中存在的蛋白质大多为醇溶蛋白，使用乙醇作为提取溶剂会溶出较多的蛋白质，使得玉米黄色素纯度较低，因此本研究在论证乙醇可溶出蛋白质的基础上，选择了提取溶剂。同时，由于玉米黄色素是极性差异较大的类胡萝卜素混合物，由极性较大的叶黄素、玉米黄素及极性较小的α－胡萝卜素、β－胡萝卜素等物质组成[4]，采用单一极性的溶剂提取不利于各组分溶出，因此本研究使用混合溶剂为提取。 采用蛋白酶水解处理原料后再提取色素的方法可有效提高玉米黄色素的得率[5]，本研究对蛋白酶的水解条件进行研究，最终确定最佳的蛋白酶水解条件。 1材料与方法 1.1试验材料、试剂与仪器 玉米蛋白粉，北京大发正大饲料厂;1398－中性蛋白酶1 2709－碱性蛋白酶，北京房山酶制剂厂;石油醚(沸程60－90℃)、丙酮、正己烷、柠檬酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硼砂均为分析纯。 旋转蒸发仪RE－52，上海亚荣生化仪器厂;SHB－3循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司;TDL－5－A型低速台式大容量离心机，上海安亭科学仪器厂;WG－2003－SBC台式干燥箱，重庆四达试验仪器有限公司;721分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;TU－1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。 1.2试验方法 1.2.1提取溶剂的选择 取10.0g玉米蛋白粉，分别用无水乙醇、95％乙醇以及丙酮和石油醚混合溶剂为提取溶剂，避光索氏提取至提取液无色，用凯氏定氮法测定所得玉米黄素中蛋白质量[6]。 经上述试验确定了丙酮和石油醚混合溶剂为提取溶剂。 1.2.2蛋白酶水解试验 对影响蛋白酶水解的蛋白酶种类、底物浓度、水解温度、pH值、水解时间以及酶浓度等单因素进行研究。 蛋白酶水解工艺流程为:称取一定量的中性蛋白酶置于250 mL的锥形瓶中，用酶缓冲液充分溶解后加入10.0g玉米蛋白粉，搅拌混匀，置于一定温度的水浴中水解一定时间后，全部移入离心管，离心，弃去上清液，将残渣置50℃烘箱中热风干燥，以丙酮:石油醚=1:1 (v/v)混合溶液为提取溶剂，避光提取，至提取液无色，用旋转蒸发仪将溶剂挥干，正己烷定容至50mL，445nm处测定吸光值。 1.2.3酶活力测定方法[7] 蛋白酶活力为1g固体酶粉(或1 mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸为一个酶活力单位，以μ/g表示。采用紫外分光光度法测定。 2结果与讨论 2.1提取溶剂的选择 本研究中使用的玉米蛋白粉经测定含有蛋白质66.2％，分别用无水乙醇、95％乙醇和丙酮:石油醚=1: 1( v/ v)的混合溶剂提取玉米黄色素，凯氏定氮法测得蛋白质含量分别为1.6％、6.1％和0.04％。 结果表明，使用乙醇直接提取玉米黄色素，会溶入较多的蛋白质，从而影响玉米黄色素的提取纯度，而采用混合溶剂丙酮:石油醚=1: 1(v/ v)提取玉米黄色素，可有效地减少了蛋白质对黄色素纯度的影响。 初步确定混合溶剂后，对丙酮－石油醚混合溶剂比例进行研究，结果见表1。 从表1可以看出，随着丙酮比例的提高，玉米黄色素的提取效果有所提高，但不显著，考虑到丙酮的极性较强会使提取的玉米黄色素中含有较多的杂质，因此最终选择丙酮:石油醚＝1: 1 (v/v)为提取溶剂。 2.2蛋白酶水解条件试验 2.2.1蛋白酶水解的单因素试验 2.2.1.1蛋白酶活力测定及蛋白酶选择 经测定，2709－碱性蛋白酶. 1398－中性蛋白酶的酶活力分别为21.5万μ/g . 18万μ/g 。取10.0g玉米蛋白粉在酶浓度为1.2％、底物浓度5％、pH值7.0、温度40℃条件下水解6h , 2709－碱性蛋白酶及1398－中性蛋白酶的吸光值分别为0.64及0.72 ,结果表明，中性蛋白酶在同等条件下的水解效果比碱性蛋白酶好，因此试验确定采用中性蛋白酶。 2.2.1.2底物浓度对玉米黄色素提取效果的影响 取10.帷玉米蛋白粉，使用中性蛋白酶在酶浓度为1.2％、pH值7.0、温度40℃条件下水解6h。 从图1可以看出，底物浓度较低时，提取效果随底物浓度增大而增加，底物浓度低时酶相对过量，底物与酶可以充分结合得以水解，因此随着底物浓度的增加，提取效果增加。但当底物浓度超过5％以后，提取物的得率降低。原因是随着底物浓度的增加，酶量也相对减少，导致底物不完全水解，提取效果呈下降趋势。另外，还可能是由于植物蛋白中含有植物蛋白酶抑制剂，能与蛋白酶作用于底物共享蛋白酶的结合基团，表现出竞争抑制性。由于底物浓度对于玉米黄色素提取率的影响较大，因此把该因素确定为均匀设计试验的一个因素，其最终确定值在试验中得出。 2.2.1.3 pH值对玉米黄色素提取效果的影响 取10.0g玉米蛋白粉，使用中性蛋白酶在酶浓度为1.2％、底物浓度为5％、温度40℃条件下水解6h，由于1398－中性蛋白酶最适pH值为6.6－7.4，因此pH值分别选用6.6、7.0、7.4。结果表明，pH值对玉米黄色素提取的影响不大，pH值6.6及7.4提取效果稍差，因此pH值确定为7.0。 2.2.1.4水解时间对玉米黄色素提取效果的影响 取10.0g玉米蛋白粉，使用中性蛋白酶在酶浓度为1.2％、底物浓度为5％、pH值7. 0、温度40℃条件下水解，结果见图2。 从图2中可以看出，水解时间较短时，由于蛋白质水解不完全，色素与蛋白质的结构破坏不够完全，不利于玉米黄色素的提取;水解时间过长时，虽然采取了相应的避光和避氧的措施，但是体系并非完全密闭，因此游离出的玉米黄色素稳定性会受到一定影响。由于提取时间对于玉米黄色素的影响较大，因此确定为均匀设计试验的一个因素，该因素的最终值在均匀设计试验中确定。 2.2.1.5水解温度对玉米黄色素提取效果的影响 取10.0g玉米蛋白粉，使用中性蛋白酶在酶浓度1.2％、底物浓度5％,pH值7.0条件下水解6h，由于蛋白酶最适温度为35-45℃，因此温度分别选用35℃，40 ℃ ,45℃。结果显示温度为40℃时提取效果最好，其光值为0. 87, 35℃时吸光值为0. 805 ,酶活力相对较低;45℃时吸光值为0.82。有文献报道类胡萝卜素在40℃以下较稳定[8]，因此45℃时玉米蛋白粉中的游离玉米黄色素受温度影响可能发生降解从而降低得率。所以可确定水解的最佳温度为40℃。 2.2.1.6酶浓度对玉米黄色素提取效果的影响 取10.0g玉米蛋白粉，使用中性蛋白酶在底物浓度为5％、pH值7.0、温度40℃条件下水解6h，结果见图3。 由图3可以看出，酶浓度低于或高于1.4％时，提取效果均不好。这是因为酶浓度较低时，底物蛋白质相对过量，不利于蛋白质结构的破坏，致使玉米黄色素的得率较低。而酶浓度为1.4％和1.6％时提取效果相差不大，在生产中需要考虑降低成本，提高蛋白酶的利用率，所以不宜选取酶浓度为1.6％。 由于酶浓度对于玉米黄色素的影响较大，因此确定为均匀设计试验的一个因素，该因素的最终值在均匀设计试验中得出。 2.2.2蛋白酶水解均匀设计试验 在以上的单因素试验中，每组试验只考察一个因素，而水解的最优条件并不是简单的这些单因素试验最佳结果的叠加，还需通过均匀设计试验来考察多因素的叠加效果，采用3因素4水平构建均匀设计表进行主因素优化试验见表1。 2. 3优化试验与分析 表2 U12 (1212)试验因素及水平 Table 2 Factors and levels of U12 (1212) experiments 因 素 水平编码和编码值 1 2 3 4 酶浓度％（a） 1.0 1.2 1.4 1.6 底物浓度％(b) 3 4 5 6 水解时间h (c) 2 4 6 8 表3 试验方案及测定结果 Table 3 Design and results of experiment 试验号 试验因素与水平编码值 Y/mg/mL a b c 采用均匀试验设计回归分析程序对试验结果进行拟合，得到以水提液中黄酮类化合物浓度Y为因变量，3个因素的水平编码值为自变量的回归方程为: Y=2. 0875-0.0499a-0.0010b-0.0127c+0.0001bc F检验表明，F=4. 632 > (4.120=F0.05( 4, 7) )。表明方程显著，且置信度大于95％，可用于定量描述自变量与因变量间的变化规律。 表4 回归分析结果 2697 根据标准回归系数的绝对值(表4), 3个因素对Y影响的主效应为c>b>a，说明在所选定的3个因素中，水提时间对Y的效应最大，其次是提取温度，水的pH值的效应相对较小。 对方程进行单因素分析表明，当b固定时，Y与c呈负相关关系，即随着c的延长，Y逐渐下降;当c不变时，Y与b亦呈负相关关系，但下降速率较平缓。 另外，由极差分析可知，最优化因素水平组合为a4b4c1，即酶浓度为1.4％、底物浓度为5、水解时间为6h，验证性试验表明，以此优化因素水平组合，测得吸光值为0.905，与直接提取法0.399相比，得率提高了126.8％。 3结论 本研究证明，使用乙醇提取会使玉米黄色素因溶入蛋白质而影响纯度，而且玉米黄色素为极性不同的混合物，采用单一溶剂提取不利于各个组分溶出。因此本研究选用丙酮:石油醚＝1: 1 (v/v)作为提取溶剂，与多数研究采用乙醇作为提取剂相比，既可避免醇溶蛋白质等杂质溶出的问题，提高了玉米黄色素纯度，又提高了玉米黄色素的得率。 本研究在改进提取溶剂的基础上，玉米黄色素的得率比直接提取提高了126.8％。经单因素试验和均匀设计试验得出的最佳水解条件为:中性蛋白酶在底物浓度5％、酶浓度1 .4％、pH值7.0、温度40℃条件下水解6h。 参考文献 [1]唐雪蓉，范路.天然食用玉米黄色素[J].淀粉与淀粉糖，1995，(3):13－16. [2]Blessin C W. Carote noids of corn and sorghum I. analytical procedure[J].Cereal Che m，1962，39:236－242 [3]Blessin C W，Brecher J D，Dimler R J . Carotenoids of corn and sorghum V，distribution of xanthophylls and carotenes in hand dissected and dry2milled fractions of yellow dent corn[J].Cereal Chem，1963，40:582－586. [4]王璋.食品化学[M]..北京:中国轻工业出版社，1999. [5]吕欣，毛忠贵.玉米黄色素研究进展[J]..粮食与油脂，2003 , (4):43－45. [6]李浩明.万寿菊叶黄素及其生理功能研究概况[J]..中国食品添加剂，2001，(4):31－35. [7]张志华，堪伟，罗倩等.玉米蛋白粉黄色素提取工艺研究[J]..粮食与油脂，2002 (11):5－6 [8]崔凌飞，王遂.玉米皮色素提取及其稳定性研究[J]..食品科学，2002，(5):66－70. |
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