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xiaoxiao70

新虫 (初入文坛)

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[求助] 关于雄性不育基因的克隆，目前卡在5’3‘端

我在克隆一个雄性不育相关基因，中间片段已经通过同源性设计的引物克隆得到，现在在用染色体步移的方法去克隆两端，用的是宝生物的genome walking的试剂盒，每次二三次pcr出来的丰度不是很大，但是可以切胶回收得到。然后送去测序，总是没有结果。
附测序公司的回信：
您的PCR样品5’(2)，3’(2)（使用相对应的引物）测序后发现有重叠现象,我们怀疑是由以下几个方面的原因造成的：
1.已纯化的PCR样品造成这种情况的原因是由于模板纯化有一定问题，模板中含有非特异性的条带；
2.如果是未纯化的PCR产物，那么有可能是您要求测序的片段周围含有大小相近的条带，我们通过琼脂糖凝胶回收，无法有效切除这种大小差别不是很明显的条带；
3.模板或是引物质量较差，测序反应结束之后没有产生足够的目的产物，导致测序信号较弱，杂背景较高，形成重叠现象。
这些原因都可能造成PCR样品测序之后出现重叠现象.建议您改进后重新进行测序。

附图是三次pcr 1%琼脂糖凝胶电泳全部点样后的图。

5\' 123 2012-9-11.jpg

3\' 123 2012-9-19.jpg

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