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牧歌ping

铜虫 (小有名气)

[求助] Xho1和EcoR1双酶切,切不开

我的目的片段是400bp左右,两端引入Xho1和EcoR1酶切位点,它们有共用的H buffer,双酶切怎么都切不开,单个酶切却都能切开;分别先一个酶切后乙醇沉淀,再另一个酶切,仍然切不开,很郁闷!
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Zedone

木虫 (正式写手)

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-09 14:10:31
楼主,既然单酶切能切开,那么说明酶没有问题。我建议你这么做,首先,随便选两个酶其中的一个进行单酶切,然后再进行胶回收;接着用另外一个酶对回收后的产物进行单酶切。这样子的话,肯定能切开。但是首先一定要保证原先的PCR产物的浓度要高,否则两次胶回收后的东西浓度会不够。一般400bp的片段很容易连接上的。希望能帮到你。加油
15楼2012-11-08 22:04:57
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475502411

铜虫 (著名写手)

他们有公用的Buffer,但是在这个公用Buffer中的活性怎么样?如果活性太低的话要延长酶切时间的。
其实单酶切是可以的,不用醇沉,我经常做
你先用一个酶切,然后不要跑胶直接回收
然后再有另外一个酶切
都选他们活性最高的Buffer
第二个酶切后再跑胶回收
这样是不会有任何问题的应该就能切开了
但是要保证你的浓度,用第一个酶切的时候可以多做两管,用一个柱子回收,然后再用少量的洗脱液洗脱就好了、
祝你顺利
可以朝九晚五,也能浪迹天涯
2楼2012-11-06 11:29:31
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jiangyinshen

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
牧歌ping: 金币+1, 有帮助 2012-11-07 09:28:10
体系需要优化,酶切时间要延长,最好过夜,再做不出来的话就换试剂了
不是風動,亦非幡動,仁者心動
3楼2012-11-06 12:02:44
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
牧歌ping: 金币+2 2012-11-07 09:28:02
楼主的目的片段怎么得来的?PCR然后胶回收吗?如果是胶回收的话,胶回收过程的乙醇对酶切影响很大,乙醇一定要挥发干。。。
keepon
4楼2012-11-06 14:02:30
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