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cwnboy2008金虫 (小有名气)
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[交流]
细胞裂解中DNA酶消化问题
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各位园友、前辈们： 我目前需要做一个胞质蛋白的纯化，1000mL的细胞悬液，密度大约在3.8*10E4/mL，准备用Throme的RIPA来做裂解， 我们平时做pilot experiment 的时候都是用这个RIPA，并且按照protocol来操作，但是也会加入适量的PMSF(working Con.=1mM)来防止蛋白的降解，还会加入DNase I(amresco的粉末状商品，自己用纯水配置了DNase I的浓缩储存液10mg/mL，工作浓度在20mg/L)来做DNA的消化，用来消除DNA带来的粘稠问题。基本1mL的裂解体系，每次都能成功抽提到蛋白(前提是蛋白确实表达了)。 但是现在碰到的问题是裂解体系放大了很多，之前做过500mL的裂解体系，PMSF的量还是1mM，同时还加入了Roche的cocktail EDTA-free片剂来防止蛋白降解，还加了DNase I(working Con.=20mg/L)，还加入了RNase(working Con.=10mg/L)，但是几次之间的裂解效果还是有差异，有的还是较为粘稠，离心完，离心管底部的胶片、果冻状沉淀根本帖服不牢，稍微一晃动就漂浮起来，没法收集上清；而有的批次的裂解就较为澄清，离心后也较易收集上清，蛋白上柱纯化效果也不错。 放大后裂解体系的操作步骤： 1. 500mL细胞悬液离心收集细胞，弃上清； 2. PBS重悬细胞，离心，洗涤两次（实验室用的全部是无血清培养基，如果不洗涤不知道是否会影响后面的PMSF、cocktail或者DNase I 的活性），弃上清； 3. 先用少量RIPA重悬细胞，同时加入PMSF和cocktail(提前用少量的PBS溶解)，用5mL的移液器或者移液管吹打，再添加至相应的裂解体系(500mL)； 4. 至4度摇床上缓慢摇荡，15min； 5. 观察裂解效果，加入DNase I 和RNase，上下颠倒震荡，并随时观察核酸的消化与裂解液粘稠情况； 6. 若上一步消化不明显，则适当延长消化时间，但限于置冰上操作； 7. 10500g，4度，离心，收集上清； 8. 纯化步骤(略)。 (以上红色加粗部分的操作是否恰当，请指正) 疑问点： 1. RIPA本身裂解细胞的效果一直都还不错，就是核酸的存在影响太大，如何有其他高效的方法去除核酸的干扰； 2. throme公司的RIPA都是优纯级试剂，但不确定是否是EDTA-free的，如果有EDTA是否会影响DNase I的活性； 3. DNase I是否可以配置成水溶液，长期储存，对活性有多大影响，本实验中是否是因为DNase I本省保存不当而造成了活性下降； 4. DNase I的最佳活性是在37度，而我们为了防止蛋白降解，一直在4度操作，也是不是影响其活性的关键，如果必须使用，如何解决这个矛盾； 5. 有的网友在使用RIPA裂解细胞时，会特意添加EDTA来帮助消散细胞(当然，这主要针对组织快裂解类型的实验，如果在裂解步骤引进EDTA，后面如果衔接DNase I的消化问题) 6.DNase I的消化一般都建议添加Mg2+-free或者Ca2+-free来提高其活性，请问这种必要性有多大 问题可能有点多，有点罗嗦，都是为了让您一次就能了解全部情况和问题所在，请谅解。谢谢您的参与与回答，谢谢。 |
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