[交流] 分离原代肝细胞和原代脂肪细胞的得到的杂细胞如何去除？ 已有1人参与

最近在做原代肝细胞和脂肪细胞的分离，可是拿到的细胞产率很低（估计0.6-0.7g肝最后才得到了800-1000万细胞；0.5g附睾脂肪最后得到了20万左右的细胞），并且杂细胞数量也很多，都是小小的细胞（比肝细胞和脂肪细胞要小）。大家看下我的protocol，要怎么改进才可以拿到产率比较高的并且比较纯的肝细胞和脂肪细胞？ 我的protocol是： 1. 取下小鼠肝组织(on ice)，置于35mm Dish中，于天平称重。 2. 取0.6-0.7g 左右肝组织于6孔板中，用DPBS（25mMHEPES,0.2mM EDTA,PH=7.4）洗两遍，剪碎(<2-3 mm pieces in diameter)。 3. 将剪碎的肝组织置于15ml 离心管中，加入5ml HBSS(1mg/ml collagenase（ Worthington 2型酶）, 25mM HEPES,PH7.4), 在37度,150rpm 消化 1h 30min。 4. 用100um细胞筛过滤至50ml 离心管中，转移至15ml 离心管中， 800rpm 离心5min，吸去上清。 5. 加入5ml HBSS (25mM HEPES, PH=7.4)，800rpm离心3min。将上清吸走，如此反复两次。 6. 吸走上清，加入4ml RPMI 1640 (10%FBS)。 7. 吸取10ul重悬液与10ul台昐蓝混匀，细胞计数。 8. 100,000hepatocytes/well 种于6孔板，班底预先用100% FBS浸润。 成熟脂肪细胞的分离步骤与肝细胞类似，缓冲液和消化液都一样，只不过没有经过过细胞筛，消化完后直接1000rpm离心5min，然后溶液就会分层，上层为成熟脂肪细胞，中层为脂肪组织，下层为前脂肪细胞。取上层脂肪细胞，然后再洗两遍，800rpm离心。 因为我实验的需求，我不能把全部的肝和脂肪去做原代细胞分离，所以，只能取一小部分，我最后只要拿到30-50万纯的肝细胞和脂肪细胞就可以。我预想中应该肝中会掺有部分红细胞，最后细胞计数时确实有很多小小的细胞，可能是红细胞，但是红细胞理论上应该是不贴壁的，可是我培养了24h和48h后，换液，用PBS洗一遍，再镜下观察，视野中还是有很多小小的细胞，所以我猜杂细胞可能不全是红细胞，这个杂细胞如何将它去除掉呢？ 还有就是如何提高产率和细胞活力？我用小鼠2/3的肝才拿到了不到1000万细胞，产率太低了，我用的是1mg/ml collagenase（ Worthington 2型酶）37度消化1个半小时，怎么才得到这么少？一种原因可能是我肝组织块剪得不够碎，但我觉得我剪了至少有3分钟，碎的程度应该也还好。还有就是我的肝在操作的过程中，并没有完全敷在冰上，并且因为是新手，操作的过程时间有点长，这个会不会影响比较大？ 分到的原代细胞活力的活力也不是很好，贴壁很不牢，在24h 和 48h 用PBS 洗的过程中，都损失的很多细胞，我加PBS洗的时候都是很小心的轻轻晃两下就洗出来了，而且只洗了一遍，就加入新的培养液。 之前分过原代细胞的童鞋帮帮我啊，我现在快急死了！细胞分不出来，根本没法进行下一步实验，小鼠确越养越大，再养就成老鼠了... 200X pbs washed.jpg 200X unwashed.jpg 200X unwashed.jpg 200X pbs washed.jpg 200X unwashed.jpg 40X-pbs washed.jpg 40X pbs washed.jpg 40X unwashed.jpg 40X unwashed.jpg

回复此楼