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孤星残月铁虫 (小有名气)
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[求助]
定量实验遇到困难
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| 本人做定量，设计了一对引物扩增后跑胶总是两条带，检查后发现引物特异性不好，与其他序列有十一二个碱基可以互补。重新设计引物发现整个序列上设计出的引物特异性都不好，肿么办呀！有说提高退货温度可以是扩增的特异性提高，不知各位高手怎么看啊！ |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-10-24 21:07:47
孤星残月: 金币+2, ★有帮助, 谢谢了，我回去试一下吧 2012-10-26 08:38:50
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递减PCR： 某些实验材料PCR时使用的引物在常规循环条件下会产生非特异性扩增。在这种情况下，使用常规PCR的改良方法—递减PCR来降低非特异性的扩增。在PCR 的前几个循环中，选择的退火温度高于引物融解温度；然后退火温度每隔1个或2 个循环降低1°C直到达到理想的或实验设定的退火温度。在剩下的循环中选择设定的退火温度。通过这种方法，目标产物的富集程度高于非特异性产物。 以下是引物设计原则，建议楼主考虑重新设计引物 • PCR引物长度通常为15-30个核苷酸。 • 引物优化的GC含量为40-60%。如果C和G核苷酸在引物中均匀分布更理想。 • 在引物的3’-末端保留1 - 2个G 或C碱基，但是要避免超过3个G或C碱基，否则会增加非特异性起始扩增的风险。 • 避免引物内部或引物之间的互补和引物内部的直接重复，这样可防止引物形成发夹结构或产生引物二聚体。 • 检测可能导致引物和模板DNA之间可能形成非特异性互补的位点。 • 设计简并引物时，在其3’-末端保留至少3个保守核苷酸。 • 常规PCR时，两个引物的融解温度(Tm)差不要超过5°C。 以上均来源于thermoscientific 官网 |
2楼2012-10-24 20:25:26
