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longxixi银虫 (正式写手)
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[求助]
有用过clontech的cDNA合成试剂盒的么？
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| 有用过clontech的cDNA合成试剂盒的么？想请问盒子合成出来的cDNA怎么样设计引物可以扩得出目的基因的全长cNDA？就是末端那段引物应该怎么设计还是直接用盒子里面自带的引物，然后我再设计一条下游或者上游引物就行了？ |
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【答案】应助回帖
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你说的是clontech SMARTer RACE试剂盒吗？ 扩增全长的原理是，假设已知目的基因中间一部分序列，需要知道5‘端序列，就做5’RACE，而需要知道3‘序列就做3’RACE。在逆转录反应完成后，获得的cDNA叫做RACE-ready cDNA。根据你的需要，也是分为5‘-RACE-Ready cDNA和3’-RACE-Ready cDNA。5‘RACE-Ready cDNA在所有cDNA的5’端有一个精心设计的接头，试剂盒里配备了可以从这个接头扩增cDNA的正向引物UPM，配合你根据已知片段设计的引物作为反向引物就可以扩增5‘PCR产物，连接到载体后测序可以获知已知序列的5’端序列。相类似地，3‘RACE-Ready cDNA也在所有cDNA的3’端有同样的一个接头，你需要根据已知序列设计基因特异性的正向引物，结合试剂盒提供的反向引物（就是5’RACE PCR的正向引物）进行扩增，测序，获知3‘序列。结合5’RACE和3‘RACE的测序结果，可以合并出全长的cDNA序列。此时就可以设计引物进行从最5’端到最3‘端，所谓End-to-End PCR，扩增cDNA全长了。值得注意的是，一次RACE反应有可能没有获得到末端的5‘或3’序列，需要根据新获得的RACE结果设计更上游或更下游的基因特异性引物进行新一轮的RACE PCR。 如果已知序列不是cDNA的末端，就需要进行两个方向的RACE才能知道全长序列，因此并不能在RACE-Ready cDNA刚刚合成好，没有进行RACE PCR时扩增全长cDNA。技术上就是先获得全长序列信息，然后获得全长PCR产物的。 |
2楼2012-12-04 12:41:03