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Mr泡面

金虫 (小有名气)

[求助] 关于DTNB的使用

本人正在做酶的巯基含量测定，查了很多文献都是用DTNB对酶巯基数目进行测定，发现几个问题：
1、原先是用pH6.8的缓冲液配制的DTNB与脲酶进行反应，结果在412nm处不显颜色。2、改在pH8的缓冲液中脲酶与DTNB进行反应，发现随着DTNB的浓度越高，反应液显色越深，但是本底（脲酶的配制溶液+DTNB液）也基本显示一样的颜色。
3、怀疑DTNB在pH8的液体中会显色，所以直接把DTNB调至pH=8，也显示一样的颜色。
4、之前也有用过半胱氨酸和DTNB在pH6.8的时候进行反应，结果马上显色，在412nm处有很高的吸光度。
想问一下各位，DTNB的使用pH有没有什么特殊的要求，是不是在pH8或者某个pH值下会有显色呢？还有，脲酶算不算巯基丰富的酶，我查了很多文献，基本上人家测脲酶中的巯基都是用DTNB的，求解答，谢谢

[ Last edited by Mr泡面 on 2012-10-19 at 17:01 ]
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1楼 2012-10-19 16:49:13
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Mr泡面

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by enoch_lei at 2012-10-20 05:00:25
你配置DTNB使用的的是多少浓度的pH8.0 buffer, DTNB浓度是多少？我做过一次，10mM DTNB stock in 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, diluted into 0.2 mM DTNB in buffer, then add certain amount of  thiol in to 2 ml 0. ...

我用的0.4M的PBS，DTNB用到很高的浓度
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4楼2012-10-20 09:15:25
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enoch_lei

铜虫 (初入文坛)
你配置DTNB使用的的是多少浓度的pH8.0 buffer, DTNB浓度是多少？我做过一次，10mM DTNB stock in 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, diluted into 0.2 mM DTNB in buffer, then add certain amount of  thiol in to 2 ml 0.2 mM DTNB, make sure DTNB is excess and make sure total obs is lower than 1.2, it worked out for me.
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3楼2012-10-20 05:00:25
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Mr泡面

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by enoch_lei at 2012-10-20 05:00:25
你配置DTNB使用的的是多少浓度的pH8.0 buffer, DTNB浓度是多少？我做过一次，10mM DTNB stock in 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, diluted into 0.2 mM DTNB in buffer, then add certain amount of  thiol in to 2 ml 0. ...

请问你是用含巯基的化合物还是酶类？
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5楼2012-10-20 12:17:13
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enoch_lei

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Mr泡面 at 2012-10-20 09:15:25
我用的0.4M的PBS，DTNB用到很高的浓度...

你看看文献一般DTNB加多少？一般可能20倍蛋白的量就好，你的buffer pH是多少啊？你可以单扫一下DTNB，然后扫一下DTNB加蛋白，我觉得你有可能DTNB量太高了，给你发一篇文献，你看看，http://www.jbc.org/content/276/36/33588.full
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Mr泡面
7楼2012-10-21 04:51:51
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