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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒PCR用来验证阳性的可靠性
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mine8008

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2012-10-09 11:04:15
质粒PCR可靠性是很高的。
可以切开。你选择的酶或许没选对。

我的目的片段两端就是这两个位点
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11楼2012-10-10 08:35:39
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by mine8008 at 2012-10-10 08:35:39
我的目的片段两端就是这两个位点...

如果确定酶切位点是在的，那请CHECK你的酶是否过期以及反应条件是否正确。做个阳性对照。
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12楼2012-10-10 10:40:28
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by mine8008 at 2012-10-10 08:32:39
那应该用什么样的体系呀，我用的是目的片段5，载体3，T4酶1，BUFF1...

连接体系目的基因片段与酶切载体的摩尔比应在3：1到6：1之间，个人觉得可以适当增大目的基因的量。
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生物化学与分子生物学
13楼2012-10-10 15:56:29
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xuzhuobin

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-26 13:34:29
应该是酶切的问题，质粒PCR已经证明了质粒携带目的DNA，所以在酶切方面找找原因。。。另外还有一种可能，我之前也遇到过，引物有错误，有缺失或者突变，我就是在引物酶切位点的地方缺失了一个碱基，结果可想而知，PCR有却酶切不开。建议你送去测序看看
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14楼2012-10-12 09:22:51
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review

银虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wind20020108 at 2012-10-09 19:32:22
用通用引物，菌液PCR即可

这个说得好
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交流
15楼2012-10-12 15:52:15
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chenxiang29

银虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by review at 2012-10-12 15:52:15
这个说得好...

菌液含有培养基的话会不会影响pcr呢
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smile to the world
16楼2012-10-25 20:37:27
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review

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by chenxiang29 at 2012-10-25 20:37:27
菌液含有培养基的话会不会影响pcr呢...

不会的   都是这么弄的啊
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交流
17楼2012-10-26 08:10:01
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你用的体系应该按照你的T4连接酶的要求算出最佳体积比，一般最佳摩尔浓度比为1:3，然后算出体积比才是你想要的结果
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18楼2012-10-26 08:45:07
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-26 13:34:42
PCR应该还是靠谱的啊~酶切切不开原因太多了，提的质粒有杂质干扰，质粒有甲基化位点正好切不开，酶过期了失效等等
实在不行就换一组酶来切呗
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19楼2012-10-26 08:45:48
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