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mine8008

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2012-10-09 11:04:15
质粒PCR可靠性是很高的。
可以切开。你选择的酶或许没选对。

我的目的片段两端就是这两个位点
11楼2012-10-10 08:35:39
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by mine8008 at 2012-10-10 08:35:39
我的目的片段两端就是这两个位点...

如果确定酶切位点是在的,那请CHECK你的酶是否过期以及反应条件是否正确。做个阳性对照。
12楼2012-10-10 10:40:28
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by mine8008 at 2012-10-10 08:32:39
那应该用什么样的体系呀,我用的是目的片段5,载体3,T4酶1,BUFF1...

连接体系目的基因片段与酶切载体的摩尔比应在3:1到6:1之间,个人觉得可以适当增大目的基因的量。
生物化学与分子生物学
13楼2012-10-10 15:56:29
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xuzhuobin

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-26 13:34:29
应该是酶切的问题,质粒PCR已经证明了质粒携带目的DNA,所以在酶切方面找找原因。。。另外还有一种可能,我之前也遇到过,引物有错误,有缺失或者突变,我就是在引物酶切位点的地方缺失了一个碱基,结果可想而知,PCR有却酶切不开。建议你送去测序看看
14楼2012-10-12 09:22:51
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review

银虫 (著名写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by wind20020108 at 2012-10-09 19:32:22
用通用引物,菌液PCR即可

这个说得好
交流
15楼2012-10-12 15:52:15
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chenxiang29

银虫 (正式写手)

引用回帖:
15楼: Originally posted by review at 2012-10-12 15:52:15
这个说得好...

菌液含有培养基的话会不会影响pcr呢
smile to the world
16楼2012-10-25 20:37:27
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review

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by chenxiang29 at 2012-10-25 20:37:27
菌液含有培养基的话会不会影响pcr呢...

不会的   都是这么弄的啊
交流
17楼2012-10-26 08:10:01
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你用的体系应该按照你的T4连接酶的要求算出最佳体积比,一般最佳摩尔浓度比为1:3,然后算出体积比才是你想要的结果
18楼2012-10-26 08:45:07
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-26 13:34:42
PCR应该还是靠谱的啊~酶切切不开原因太多了,提的质粒有杂质干扰,质粒有甲基化位点正好切不开,酶过期了失效等等
实在不行就换一组酶来切呗
19楼2012-10-26 08:45:48
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