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weining1203

新虫 (小有名气)

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[求助] pcr产物胶回收浓度低，能不能和T载体连接

小弟最近做基因克隆，目的片段2200bp，pcr产物条带亮度和2000的marker差不多，pcr体系为50ul，全部用来胶回收，回收后浓度太低，只有16ng/ul
,不知道能不能和T载体连接？ T载体为 pMD-18T simple Vector。求大神指点

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1楼2012-09-30 21:40:23

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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
weining1203: 金币+8, ★★★很有帮助, 非常感谢您！因为没做过，周围也没有认真做，所以不知如何下手 2012-10-02 08:23:28

引用回帖:

7楼: Originally posted by weining1203 at 2012-10-01 08:44:25
T载体为 pMD-18T simple Vector，说明书连接体系只有5ul： Vector 1ul（50ng）
insert dna ...

我知道说明上是10ul体系，不过你可以连20ul，载体和片段用量一样，也就是稀释一倍的体系。一般试剂盒的vector是按数给的，buffer总是多一些的。不用知道DNA的mol数，因为粗略地算，双链DNA的分子量与碱基数成正比。一般做连的话是载体：插入片段的分子数=1:3. 载体放50ng。我上面已经给你写了公式，插入片段ng数=50*2.2/2.7*3=122 ng。你的浓度为16ng/ul，需7.6 ul。虽然大于5，可以用20ul体系连，加10ul的buffer，1ul酶，1ul载体，0.4ul水。