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heshengfa

木虫 (小有名气)

small minds discuss people;

[求助] 表达

我刚开始做原核表达，我的表达菌是BL21(DE3)，蛋白（GST标签）是可溶性的，目前在细菌破碎方面遇到些问题，想请教一下各位前辈。
1、我想问问大家对裂解液有什么好的建议。
2、溶菌酶溶液能在-20度保存多久。大家的工作浓度是根据菌的湿重来定吗？
3、cocktail是现配现用吗，使用浓度是多少？
4、大家裂解后还超声吗，工作条件是多少？
由于是新手，问的问题有点多，希望各位不吝赐教，看回答情况会加金币。最后祝大家节日快乐。谢谢
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凡是有的，还要给他，使他富足；但凡没有的，连他所有的，也要夺走
1楼 2012-09-29 14:50:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 鼓励发帖交流 2012-10-02 06:37:18
直接超声破碎就行了，我不喜欢用溶菌酶，加了还得除去。破碎时要加蛋白酶抑制剂。cocktail按照产品说明使用。超声的条件要根据你使用的仪器优化。超声时要冰浴，一般是数秒一个循环，中间有间歇，可以在仪器上设置。要防止产生泡沫。当浑浊的菌液变得透明起来就是超好了。
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2楼2012-09-29 15:58:18
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+5, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-09-29 18:48:38
说点个人见解：
1.裂解液一般也是缓冲液的作用，在裂解细胞的同时也要保证合适的环境。个人认为这个不是特别重要（不过也要看你的实验粗放程度了），之前用水也做过，没有很大的不同。至于合适的裂解液，一般文献中都会有涉及到，可以试试。
2.对于胞内蛋白，本人一般不用溶菌酶裂解细胞。
3.也没有必要现配现用，一般4度保存是不会有很大问题的。主要是保证pH不能有很大变化，另外有没有结晶或絮状物出现等问题。
4.一般都是裂解液配合超声破碎，也可以用加玻璃珠振荡破碎。如果你只是为了检测，可以超声破碎也可以振荡破碎。如果是为了后续实验，能够用振荡破碎觉得会更好。玻璃珠用的是425-600um的，一般的生物公司都有卖，有点贵，一支酶的价钱吧，sigma的是160元/10g。
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3楼2012-09-29 17:24:27
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heshengfa

木虫 (小有名气)

small minds discuss people;

引用回帖:
3楼: Originally posted by reallpf at 2012-09-29 17:24:27
说点个人见解：
1.裂解液一般也是缓冲液的作用，在裂解细胞的同时也要保证合适的环境。个人认为这个不是特别重要（不过也要看你的实验粗放程度了），之前用水也做过，没有很大的不同。至于合适的裂解液，一般文献 ...

谢谢，我的蛋白要切除GST标签，然后免疫兔子制备多抗，我还是用裂解液配合超声吧。国庆快乐
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凡是有的，还要给他，使他富足；但凡没有的，连他所有的，也要夺走
4楼2012-10-01 09:44:03
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heshengfa

木虫 (小有名气)

small minds discuss people;

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-29 15:58:18
直接超声破碎就行了，我不喜欢用溶菌酶，加了还得除去。破碎时要加蛋白酶抑制剂。cocktail按照产品说明使用。超声的条件要根据你使用的仪器优化。超声时要冰浴，一般是数秒一个循环，中间有间歇，可以在仪器上设置。 ...

谢谢，国庆快乐
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5楼2012-10-01 09:44:47
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loop00

木虫 (小有名气)

阿凡达

【答案】应助回帖

★ ★
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wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2012-10-02 06:36:01
楼主你好，如果你的蛋白石可溶性表达的，建议不要使用强力的裂解液，比如含有去污剂的，因为有些膜蛋白、杂蛋白也会因此被溶解，建议你就用50mM的PBS加150-500mM的NaCl以及蛋白酶抑制剂就好了；杂蛋白多的话不利于后续纯化
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坚强面对生活
6楼2012-10-02 00:54:46
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loop00

木虫 (小有名气)

阿凡达
PBS超声30min左右一般细菌都破碎了，可溶性蛋白也都在PBS里面了，PBS的用量一般是LB培养基的0.05倍-0.1倍
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坚强面对生活
7楼2012-10-02 00:56:30
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heshengfa

木虫 (小有名气)

small minds discuss people;

引用回帖:
7楼: Originally posted by loop00 at 2012-10-02 00:56:30
PBS超声30min左右一般细菌都破碎了，可溶性蛋白也都在PBS里面了，PBS的用量一般是LB培养基的0.05倍-0.1倍

非常感谢。我是先用裂解液（50mM Tris (pH8.0)，150mM NaCl，1% NP-40）加溶菌酶及蛋白酶抑制剂处理30min，再超声（200W、工作3s、间隔3s）。我想这样超声的功率可以低一些，暑假时直接超声是360w，因为我看纯化手册说超声太剧烈会影响纯化，所以后来就像试试先裂解液加溶菌酶处理在超声（功率可以低点）。另外，np-40应该是很温和的去污剂。
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凡是有的，还要给他，使他富足；但凡没有的，连他所有的，也要夺走
8楼2012-10-02 09:34:04
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heshengfa

木虫 (小有名气)

small minds discuss people;

我的蛋白标签是GST，我用GSTrap FF纯化，用凝血酶切除标签。我想问一下大家，之后是用凝胶柱纯化无标签蛋白吗（我的目的蛋白分子量为14kDa）
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凡是有的，还要给他，使他富足；但凡没有的，连他所有的，也要夺走
9楼2012-10-05 09:35:42
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