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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大侠们，帮我看一下这对引物的酶切位点是什么？
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-24 10:18:29
引用回帖:
7楼: Originally posted by fit3525 at 2012-09-21 13:07:49
那要是做酶切连接到pmd18-t上，怎么连啊？我是小白，请大侠帮我一下！...

pmd18-t载体还是比较小的，不建议你用双酶切的方法去连接。
你可以设计引物将载体PCR出来。
再PCR你的目的基因，再共转化，这样效果比较好。

如果你非要双酶切连接，那就要选两个内切酶位点。设计一对基因引物，将这两个酶切位点加到引物中去。
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11楼2012-09-21 13:16:10
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fit3525

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-21 13:14:00
pmd18-t载体还是比较小的，不建议你用双酶切的方法去连接。
你可以设计引物将载体PCR出来。
再PCR你的目的基因，再共转化，这样效果比较好。...

您好，这是唯一的方法吗？能不能用常用的酶做个单酶切试试看啊？
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12楼2012-09-21 15:22:05
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by fit3525 at 2012-09-21 15:22:05
您好，这是唯一的方法吗？能不能用常用的酶做个单酶切试试看啊？...

单酶切你怎么连接呢，单酶切只是线性化，你需要的是将载体拿去一段再用另一段补上的问题。
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13楼2012-09-21 17:05:15
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dajiong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不用，这是T载体，平末端连接就可以，不需要酶切位点的。
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哦也
14楼2012-09-21 20:18:44
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junminh

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接T VECTOR连接
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15楼2012-09-23 08:29:44
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-24 10:18:46
fit3525: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-19 21:35:52
直接PCR，产物胶回收后连接T载体就好了。当然如果对保真性要求较高，可以采用高保真酶PCR目的条带，回收目标条带后用普通Taq酶加A尾后连接T载体。
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16楼2012-09-23 21:50:18
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rfengyi

禁虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
17楼2012-09-24 09:31:32
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xunmeng828

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by joan198108 at 2012-09-23 21:50:18
直接PCR，产物胶回收后连接T载体就好了。当然如果对保真性要求较高，可以采用高保真酶PCR目的条带，回收目标条带后用普通Taq酶加A尾后连接T载体。

你好！我刚涉及到基因克隆这一块，想请教一下，回收了目的条带之后，如何用普通Taq酶加A尾呢？也就是接下来怎么操作？多谢啦！
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18楼2012-10-20 21:02:50
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
18楼: Originally posted by xunmeng828 at 2012-10-20 21:02:50
你好！我刚涉及到基因克隆这一块，想请教一下，回收了目的条带之后，如何用普通Taq酶加A尾呢？也就是接下来怎么操作？多谢啦！...

回收片段加尾反应体系跟PCR体系是一样的，但是不加引物，当然也可以降低dNTPs的量，毕竟需要量很少。反应条件直接设为37℃、10min就可以了。
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19楼2012-10-21 08:47:01
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流氓一个

金虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by joan198108 at 2012-10-21 08:47:01
回收片段加尾反应体系跟PCR体系是一样的，但是不加引物，当然也可以降低dNTPs的量，毕竟需要量很少。反应条件直接设为37℃、10min就可以了。...

请教一下，加A尾是加dNTPS而不是加dATP么？
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我有我人生
20楼2014-10-11 10:46:20
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