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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-24 10:18:29
引用回帖:
7楼: Originally posted by fit3525 at 2012-09-21 13:07:49
那要是做酶切连接到pmd18-t上,怎么连啊?我是小白,请大侠帮我一下!...

pmd18-t载体还是比较小的,不建议你用双酶切的方法去连接。
你可以设计引物将载体PCR出来。
再PCR你的目的基因,再共转化,这样效果比较好。

如果你非要双酶切连接,那就要选两个内切酶位点。设计一对基因引物,将这两个酶切位点加到引物中去。
11楼2012-09-21 13:16:10
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fit3525

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-21 13:14:00
pmd18-t载体还是比较小的,不建议你用双酶切的方法去连接。
你可以设计引物将载体PCR出来。
再PCR你的目的基因,再共转化,这样效果比较好。...

您好,这是唯一的方法吗?能不能用常用的酶做个单酶切试试看啊?
12楼2012-09-21 15:22:05
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by fit3525 at 2012-09-21 15:22:05
您好,这是唯一的方法吗?能不能用常用的酶做个单酶切试试看啊?...

单酶切你怎么连接呢,单酶切只是线性化,你需要的是将载体拿去一段再用另一段补上的问题。
13楼2012-09-21 17:05:15
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dajiong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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不用,这是T载体,平末端连接就可以,不需要酶切位点的。
哦也
14楼2012-09-21 20:18:44
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junminh

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
直接T VECTOR连接
15楼2012-09-23 08:29:44
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-24 10:18:46
fit3525: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-19 21:35:52
直接PCR,产物胶回收后连接T载体就好了。当然如果对保真性要求较高,可以采用高保真酶PCR目的条带,回收目标条带后用普通Taq酶加A尾后连接T载体。
16楼2012-09-23 21:50:18
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rfengyi

禁虫 (正式写手)

感谢参与,应助指数 +1
本帖内容被屏蔽

17楼2012-09-24 09:31:32
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xunmeng828

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
16楼: Originally posted by joan198108 at 2012-09-23 21:50:18
直接PCR,产物胶回收后连接T载体就好了。当然如果对保真性要求较高,可以采用高保真酶PCR目的条带,回收目标条带后用普通Taq酶加A尾后连接T载体。

你好!我刚涉及到基因克隆这一块,想请教一下,回收了目的条带之后,如何用普通Taq酶加A尾呢?也就是接下来怎么操作?多谢啦!
18楼2012-10-20 21:02:50
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
18楼: Originally posted by xunmeng828 at 2012-10-20 21:02:50
你好!我刚涉及到基因克隆这一块,想请教一下,回收了目的条带之后,如何用普通Taq酶加A尾呢?也就是接下来怎么操作?多谢啦!...

回收片段加尾反应体系跟PCR体系是一样的,但是不加引物,当然也可以降低dNTPs的量,毕竟需要量很少。反应条件直接设为37℃、10min就可以了。
19楼2012-10-21 08:47:01
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流氓一个

金虫 (正式写手)

引用回帖:
19楼: Originally posted by joan198108 at 2012-10-21 08:47:01
回收片段加尾反应体系跟PCR体系是一样的,但是不加引物,当然也可以降低dNTPs的量,毕竟需要量很少。反应条件直接设为37℃、10min就可以了。...

请教一下,加A尾是加dNTPS而不是加dATP么?
我有我人生
20楼2014-10-11 10:46:20
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