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怀西扬

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[求助] 荧光定量相对定量标准曲线的构建方法

打算做茶花某个基因的相对定量，用2-△△Ct方法分析。
1 构建标准曲线的目的只是为了单纯看目的基因引物和内参基因引物的扩增效率是否一致吗？
有的文献里说，如果一致，比如说都是1.98，2-△△Ct应该订正为1.98-△△Ct？那要是不一致呢，该怎么办？
2 构建标准曲线的质粒需要检测浓度吗？我在一篇文献里看到如下内容：
测定质粒浓度并进行拷贝数换算，作为阳性模板。
(拷贝数计算公式是:拷贝数=(amount×6．022×1023)/(length×1×109×650)，其中amount是指OD所测含量，length代表模板DNA的长度)

另外，荧光定量中的阈值需要手工设置吗？还是说就按电脑默认值就可以了？

谢谢！！！

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1楼 2012-07-23 15:35:42

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liweiwei0812

铜虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
怀西扬: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-07-24 11:06:43

1. 相对定量中的用2-△△Ct方法分析时的标准曲线确实用于检测目的基因及内参基因的引物扩增效率，如果不一致，需要优化实验条件争取调到一致，或不要相差太多即可；
2. 相对定量的标准曲线没必要计算具体拷贝数，因为此标准品不用于绝对量的计算；
3. 荧光阈值一般为仪器默认值，如果有需要手动调整的情况需高于基线及阴性对照的荧光值，且在指数增长期范围之内。