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cexoihtydx金虫 (正式写手)
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[求助]
求嘌呤霉素筛选稳转细胞株的详细步骤
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欲使用嘌呤霉素抗性筛选细胞稳转细胞株，求 1. 确定细胞最适的嘌呤霉素浓度范围的实验步骤 2. 做转染时的嘌呤霉素筛选步骤 新手，非常感谢！ |
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2楼2012-11-01 21:48:49
肖颖2009
铁虫 (正式写手)
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- 专业: 生物物理、生物化学与分子
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哺乳动物细胞 嘌呤霉素在哺乳动物细胞系反应中的有效浓度范围从1-10μg/ml。实验初始，我们建议， 决定实验中抗生素的最适浓度的方法是首先该浓度可以杀死自身宿主细胞系。 嘌呤霉素可以迅速消灭不含有pac基因的真核细胞。死亡细胞从平板分离，该平板可以用于简单和初期的转化克隆细胞鉴定。建议筛选哺乳动物细胞的最适浓度应当低于所列浓度值。 哺乳动物细胞筛选方法 嘌呤霉素常用浓度范围在1 - 10 μg/ml。等转化出含有pac基因的质粒后，细胞在含有嘌呤霉 素的普通培养基中增殖，以筛选出稳定转染子。 1. 在转染的48小时内，将细胞（原样或稀释）置于含有适当浓度嘌呤霉素的新鲜培养基中培养。 注意：细胞在快速增殖时，抗生素作用最明显。如果细胞浓度过大，抗生素产生的效力也会下 降。细胞最好在他们融合率不高于25%时分裂最佳。 2.每隔3-4天，移除和更换含有嘌呤霉素的培养基。 3.筛选7天后评估细胞形成的病灶。病灶可能需要额外的一周或者更多时间，这依赖于宿 主细胞系和转染筛选效率。 4.转移和放置5-10个抗性克隆到一个35mm的培养皿中，用选择培养基培养7天。这次 富集培养是为日后的细胞毒性实验做准备。 |
3楼2013-02-06 14:29:54
4楼2018-04-20 09:24:17
5楼2018-04-20 09:30:15