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yanshuai511铜虫 (小有名气)
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GPCR蛋白N端连flag不表达！急！
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| FLAG 连在G 蛋白耦连的受体的N端，做了两个月了还是没有进展。测序是正确的，也没有移码。可western就是检测不到FLAG的表达。受体的ATG带着和不带着我都做了，也不表达。转染的时间24h和48h我也做过了。载体也换过，还是不表达。我看有的文章说GPCR，有的是有糖基化，所以会影响融合蛋白表达的位置。有没有做过给G蛋白耦连受体连flag的大神，帮忙分析一下。 |
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12楼2015-07-02 22:28:56
chenliang_0513
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【答案】应助回帖
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既然测序是正确的，那就应该ORF没用问题。WB做不出来的原因很多的。先手我不知道你在哪儿表达的，难道是酵母？还怕出现糖基化……如果是酵母一般不需要用wb吧，考染就看的见的；大肠杆菌表达系统一般也不需要。估计你用的还是真核表达系统。 那么你先要注意自己的载体是不是可以在真核细胞中表达？（含真核的启动子，终止序列等）以前用这个载体做过其他的基因表达没有？就是最好有正对照 其次，你最好顶一个beta-actin或GAPDH的抗体，做内参，煮的细胞就可以，如果能做出来，证明wb的操作没有问题，如果做不出来很可能就是操作的问题 我不知道你的抗体是哪个公司的，推荐用sigma的那个M4的鼠源的单抗，有些公司的不好用，效价很低 如果还有问题，再联系我吧，祝实验顺利！ |
2楼2012-07-15 16:20:07
yanshuai511
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3楼2012-07-15 16:30:42
chenliang_0513
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4楼2012-07-15 16:36:28