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a070274011新虫 (初入文坛)
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流式细胞分析分选术 已有4人参与
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1. 96 孔板样本处理 1.1 操作流程 接种细胞：3×104 /孔 药物刺激 一般作用24 小时，上机 1.2 方法 在cellquest 环境下，利用control 细胞标定上样条件，并在已设好的文件 夹(INS 文件及SET 文件)下，保存好需要的上样文件 关闭cellqest 软件， 打开MPM 软件 在MPM 软件下进行一系列设定(首先在Autosample 下， 进行SettingInitial 及FinalWashing 操作，清洗整个管路 管路清洗完毕进行 上样条件设定(主要设定上样体积(一般100ul)，混合体积(一般100ul)，混合次数， 清洗次数等，在Acquisition 菜单下设定current plate(现在使用的板号是353263)， DateStorageFolder( 即数据储存文件夹) ， AcquisitionDocument 及 InstrumentSettingsFile(上样条件从保存好的INS 及SET 文件中选定) 上样 条件设定完毕，选定96 孔板的上样范围 在Acquisition 下选择Acquire, 上样 上样完毕，退出上样板，使用次**钠及水，清洗管路(将次**钠 及水加在96 孔板上，以上样的方式清洗管路) *须知：如果使用PBS 作为上样鞘液，上样完毕后，换用水作为鞘液，并反复冲 洗管路，防止PBS 盐结晶堵塞管路。 1.3 注释 1) 必需的control：应准备一管对于检测指标为阴性的细胞(例如：若要检测 Jurkat-NF-KB-GFP 经药物刺激样本，就需要准备一管Jurkat 细胞(GFP 为阴 性))，用于标定机器的上样条件。细胞量为1×106 个/ml，1ml。 2) 上机前，应对样本进行混合，以使样本均一(注意使用排枪吹打，勿产生气泡)。 3) 以上protocol 仅针对于悬浮细胞。 4) 药物刺激浓度需先做梯度检测。 第七章 流式细胞分析分选术 42 2. Cell Cycle Assay 常用的实验细胞株包括：293(T)，MCF7，U2OS，Saos，Hela 等 以U2OS 细胞为例 2.1 细胞培养及铺板 1) 细胞株及材料： a) 细胞株： U2OS 细胞 b) 培养基： DMEM(10%FBS，GBICO)，DMEM(无血清) c) 培养器皿：75cm2 培养瓶,6cm 培养皿 2) 细胞培养及铺板： a) 传代：用DMEM(10%FBS) 培养基接种U2OS 至75cm2 培养瓶，细胞长 满后铺板并传代。 注：一般一瓶细胞总数可以达到1×107 个 b) 铺板： 细胞消化：将培养好的U2OS 细胞，倾去培养基，加入2ml 1×胰酶轻轻 摇晃以覆盖整瓶细胞，37℃培养箱放置2-3min，观察细胞从 瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁)，显微镜下观测到细胞 成单个，或是只有2-3 个细胞聚团，即可以加入5ml 含有血清 的DMEM(10%FBS)，终止胰酶的消化作用。 细胞计数：如果细胞密度较大，可按一定倍数稀释后计数。 细胞密度(单位：个/ml)=(4 个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数 铺板： 6cm培养皿按照每孔6×105 个细胞(即1.5×105/ml，4ml) 细胞加入后将6cm 培养皿沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动 (手势一定要轻柔,防止培养液泼出)，使细胞能够均匀分布，放置细 胞培养箱生长。 注：计算铺板量时，应将control 板，药物阳性对照板及质粒对照板考虑在内。 第七章 流式细胞分析分选术 43 2.2 转染 1） 试剂及材料： a) 转染试剂：Lipofectamin 2000 b) 质粒：对照质粒：pEF-BOS p21(阳性对照) p16(阳性对照) GFP-spectin 目的基因质粒，构建在pEF-FN 载体上 注：若目的基因载体不是pEF-FN,则对应的空载体要相应变化。 2） 转染：细胞密度为50%-60%时，进行转染 A：0.3μg GFP-spectin+3μg interest gene+ serum free DMEM 至终体积500μl/ 孔。 B：9.9μL lipofectamine 2000+490.1μL serum free DMEM 体积为500μl /孔，室 温放置5min A，B 二者混合，室温放置20-30min 后将混合液缓慢而均匀的加到6cm 板 细胞液中，每板为1000μL，轻轻摇晃，使DNA 分布均匀，转染5 小时后， 换置培养液(10%FBS+DMEM)。 2.3 细胞分板 细胞分板：转染12-16 小时后, 根据细胞密度按1：3 或1：2 分板，使分 板后细胞密度为30%左右,37℃继续培养30h。 2.4 加药刺激 除了利用转染质粒作为阳性对照，也可使用药物处理细胞作为阳性对照样本 细胞铺板24 小时后，加药刺激： G1，S-arrest ：L-mimosine: 0.5mM 5-fluorourcil: 10mM G2/M arrest : nocodazole: 50ng/ml 第七章 流式细胞分析分选术 44 加药后，继续培养24 小时 附注：作为阳性对照的基因及药物的具体使用情况见附表1。 2.5 细胞收获及处理 分别收集培养液，在每个6cm 板中加入1ml 胰酶消化(细胞消化的方法同上)。 消化完毕，加入已收集的培养液(注意一一对应，防止弄错)中和胰酶。离心(300g， 5min)收集细胞，弃上清，加入2-3ml 75%乙醇(细胞量较多，可酌量多加)，votex， 充分混匀，放入-20oC 冰箱，保存。 2.6 上机样本制备 从-20oC 取出细胞样本(至少已在-20oC 放置4 小时)，离心(300g，5min)收集细 胞，弃上清。1×PBS 清洗两遍，加入100ul 1×PBS，votex 混匀，加入10ulPI(终 浓度100ug/ml)，10ulRnase(终浓度50ug/ml)，置于37oC 水浴锅，避光处理30min。 注：细胞量较多时，PI 及RNase 量应酌量增加。 2.7 上机 在cellquest 环境下，选择FL-1(GFP)及FL-3(PI)作为研究对象，先上control 样本标定上样条件，进而上其他样本。 2.8 相关试剂的配制 1．1×PBS：采用GIBCO 1×10L D’PBS(Cat.No21600-069)配制。 2．PI：以水为溶剂，母液浓度为1mg/ml，配制完毕后，4oC 避光保存 3．Rnase：以水为溶剂，母液浓度为0.5mg/ml，配制完毕后，分装冻存于-20oC 4．L-mimosine： 以无血清培养液为溶剂，母液浓度为100mM，配制完毕后， 4oC 避光保存 5．5-fluorourcil：以DMSO 为溶剂，母液浓度为549mM，配制完毕后，4oC 保 存 6．Nocodazole：以DMSO 为溶剂，母液浓度为5mg/ml，配制完毕后，4oC 保存 第七章 流式细胞分析分选术 45 附表1：阳性对照基因及药物 3.FACS analysis on Apoptosis 可用于凋亡检测的细胞，多为对细胞凋亡较为敏感的细胞，例如：MCF7, Hela 以Hela 细胞为例 3.1 细胞培养及铺板 1) 细胞株及材料： i. 细胞株： Hela 细胞 ii. 培养基： DMEM(10%FBS GBICO)，DMEM(无血清) iii. 培养器皿：75cm2 培养瓶,6cm 培养皿 2) 细胞培养及铺板： a) 传代：用DMEM(10%FBS) 培养基接种hela 细胞至75cm2 培养瓶，细胞 长满后铺板并传代。 注：一般一瓶细胞总数可以达到3×107 个 b) 铺板： i.细胞消化：将培养好的Hela 细胞，倾去培养基，加入2ml 1×胰酶轻 轻摇晃以覆盖整瓶细胞，37℃培养箱放置2-3min，观察细 胞从瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁)，显微镜下观测 基因 药物 G0/G1 P21,P16 L-mimosine: 0.5mM S 5-fluorourcil: 10mM G2/M nocodazole: 50ng/ml 第七章 流式细胞分析分选术 46 到细胞成单个，或是只有2-3 个细胞聚团，即可以加入5ml 含有血清的DMEM(10%FBS)，终止胰酶的消化作用。 ii.细胞计数：如果细胞密度较大，可按一定倍数稀释后计数。 细胞密度(单位：个/ml)=(4 个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数 iii.铺板： 6cm 培养皿按照每孔3×105 个细胞(即0.75×105/ml，4ml)接种， 细胞加入后将6cm 板沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动(手势一定 要轻柔,防止培养液泼出)，使细胞能够均匀分布，放置细胞培养箱生长。 注：计算铺板量时，应将control 板，药物阳性对照板及质粒对照板考虑在内。 3.2 转染 1)试剂及材料： 转染试剂：Lipofectamin 2000 质粒： a:对照质粒：pEF-BOS RIP(阳性对照) b:GFP-spectin c:目的基因质粒，构建在pEF-FN 载体上 注：若目的基因载体不是pEF-FN,则对应的空载体要相应变化。 2)转染：细胞密度为50%-60%时，进行转染 A：0.15μg GFP-spectin+3μg interest gene+ serum free DMEM 至终体积500μl/孔。 B：9.45μL lipofectamine 2000+490.55μL serum free DMEM 体积为500μl /孔，室 温放置5min A， B 二者混合，室温放置20-30min 后将混合液缓慢而均匀的加到6cm 培养皿 中，每孔为1000μL，轻轻摇晃，使DNA 分布均匀，转染5 小时后,换置培养 液(10%FBS+DMEM)。继续培养 3.3 细胞收获 第七章 流式细胞分析分选术 47 转染24 小时后，一旦观察到经RIP 转染的细胞明显死亡，即可收获细胞。 每板分别收集培养液，在每个6cm 板中加入1ml 胰酶(细胞消化的方法同上)， 消化完毕，加入已收集的培养液(注意一一对应，防止弄错)中和胰酶，离心(300g， 5min)收集细胞。 3.4 上机样本制备 收集细胞液(包括上清) 同时准备56℃水浴处理细胞 分别取一点 没有转染的细胞 作为control 及转染的细胞 作为GFP 单染样本 PBS 洗 染AnnexinV Ab-PE 染7-AAD 室温避光15min PE-mouse IgG 室温避光染色15min 1╳binding buffer 洗两次 染7-AAD，室温避光15min AnnexinV Ab-PE/ 7-AAD 染色，室温避光15min 3.5 上机 在cellquest 环境下，选择FL-1(GFP)，FL-2(PE)及FL-3(7-AAD)作为研究对 象，先上control 样本标定电压，域值，再用单染GFP 的细胞样本及水浴处理后 单染PE,7-AAD 的样本，调节补偿，最终确立上样条件，进而上其他样本。 注：A:用GFP 单染样本以及水浴处理的单标Annexin V-PE 样本调节FL1-H 及 FL2-H 的补偿； B:水浴处理的单标Annexin V-PE 以及水浴处理的单标7-AAD 样本调节 FL2-H 及FL3-H 的补偿。 4. CD69 检测 第七章 流式细胞分析分选术 48 (或其他类似的免疫荧光检测) 4.1 细胞培养 1)细胞株及材料： 细胞株：Jurkat-T 细胞或Jurkat 细胞 培养基：RPMI 1640(10%FBS GBICO；1%双抗)，RPMI 1640(无血清) 培养器皿：75cm2 培养瓶;175cm2 培养瓶;25 cm2 培养瓶;96 孔细胞培养板 2)Jurkat-T 细胞的培养： Jurkat-T 细胞为悬浮细胞，细胞活力好时，镜检多为10 个左右细胞聚团， 及少量游离的单个细胞，细胞圆而透亮。一般培养按密度来计算，起始培养 密度不要低于1×105 个/ml，24hr 后细胞密度即可达到2×105 个/ml，以此类推 在第五天上即可以达到1.6×106 个/ml，根据这个来调整接种密度及传代天数。 最好细胞的密度高不能超过1.6×106 个/ml。 例如，起始培养密度2×105 个/ml，体积30 ml，在第三天时, 细胞密度 达到8×105 个/ml，细胞总数达到2.4×107 个，因为检测一个待检基因的电击 所需细胞数量为1×107 个，所以，此培养的细胞数只能做2.4 个样品，因此， 根据实验所需要检测的样品数目来调整培养细胞的体积(象175cm2 的培养瓶 可以培养200-300ml 细胞悬液，细胞总数可以达到16-24×107，这样就可以做 16-24 个样品)。 4.2 电击转化 细胞总数达到检测样品所需则可转染(细胞密度最好在1×106/ml 左右)。 转染用品：电击仪，400mm 电击杯 质粒： a:对照质粒：NFAT 刺激系统：negative control:pEF-BOS positive control: SYC plasmid NFAT 抑制系统: negative control:pEF-BOS positive control: SLIM plasmid b: NFAT-luc report plasmid c:目的基因质粒，构建在pEF-FN 载体上 试剂： 台盼蓝(0.4%) 1)将Jurkat-T 细胞转到50ml 离心管中，细胞计数(细胞密度最好在1×106 左右)。 第七章 流式细胞分析分选术 49 2)1000rpm离心，用无血清的RPMI1640 培养液收集细胞，调整浓度为2.5×107/mL, 每个电极杯中加入400μl 细胞液(细胞总数为1×107 个)。 3)依次加入10μg NFAT-luc reporter gene 和20ug interest gene(体积控制在20μl 以 内)，使质粒和细胞混匀(尽量不要产生气泡)。 4)电击条件250V，950μF。电击前轻轻弹击电击杯，将杯底的细胞重悬起来，注 意不要产生气泡。电击时观察一下time constant(约为24ms)。 5)电击完后立即弹击电击杯的侧壁使细胞混匀，室温下放置30min。 6)将电极杯中的细胞加到10mL RPMI1640 培养液中(含serum)24cm2 培养瓶，培 养40hr(即培养到第三天上午)。 4.3 铺板，加药 C305：1∶60 稀释使用 PMA: 储存浓度为0.5mg/ml，应用浓度为50ng/ml(稀释10000 倍)) Ionomycin: 储存浓度为1mM，应用浓度为1μM(稀释1000 倍))； 1)将转染培养40hr 后的细胞转到15ml 离心管中，进行活细胞计数(台盼蓝染色)， 离心收细胞，调整细胞浓度为2×106/ml。 2)在96 孔板中，每孔加50μL 细胞(细胞数为1×105)，每个样品还是要做3 个复 孔。NFAT 刺激系统，NFAT 抑制系统可以同时进行，前者无需加药刺激，后 者需要做C305 抗体刺激和PMA+ Ionomycin 刺激，因此，一个样品需要做9 个复孔。按顺序在96 孔板中加入细胞，并相应做好标记。 3) 对于NFAT 刺激系统，直接在每孔中补加50μl 新鲜培养基，使终体积为100μl； 对于NFAT 抑制系统分别加入50μL C305(anti-TCR, 60 倍稀释)；或50μl PMA(50ng/mL)+Ionomycin(1μM)，刺激8-12 小时。 4.4 细胞收获及处理 将刺激8-12 小时后的细胞取出，离心收集细胞 4.5 样本制备 第七章 流式细胞分析分选术 50 A:CD69 间标法 Cells harvested 1 × PBS 清洗两遍 Cells were suspended in 1ml 1×binding buffer (1% BSA) (cell 浓度约1×106/ml) 取其中的100μl 5μl pure-Mouse IgG1 5μl Mouse anti-human CD69 (或其它一抗) (非特异性染色) 4oC 或冰上放置， 30min 1×binding buffer (1% BSA) 清洗两遍(每次4ml) 5μl PE goat anti-mouse IgG 及 5μl 7-AAD 4oC 或冰上，避光放置15min 1×PBS 清洗两遍(每次2ml) 上机 B:CD69 检测直标法 操作步骤基本同间标法，只是作非特意性对照的样本，直接用Mouse anti-human IgG-pe 直接标记 4.6 上机 第七章 流式细胞分析分选术 51 在cellquest 环境下，选择FL-1(GFP)，FL-2(PE)及FL-3(7-AAD)作为研究对 象，先上control 样本标定电压，阈值，并调节补偿，最终确立上样条件，进而 上其他样本。 4.7 几种药物的储存浓度和应用浓度 TNF 1×106U/瓶 1mg=4×107U, 1×106U=25μg 溶于12.5mL PBS 中，浓度为 2μg/mL。 储存浓度：2μg/mL 应用浓度：20ng/mL(稀释100 倍) C305 60 倍稀释使用。 PMA and Ionomycin(dissolved in DMSO) PMA:1 支1mg 溶于2ml DMSO 即0.5mg/mL(储存于-80°C) 储存浓度：0.5mg/ml 应用浓度：50ng/ml(稀释10000 倍) Ionomycin: 1mg/747.1(MW)=1.33×10-3mmol 溶于1.33ml,浓度为1mM。(储存与 -80°C) 储存浓度：1mM 应用浓度：1μM(稀释1000 倍) 5. 细胞分选 5.1 分选细胞样本处理 第七章 流式细胞分析分选术 52 贴壁细胞培养：一个细胞样本 悬浮细胞培养：一个细胞样本 至少需要一个10cm 细胞板 细胞总数应大于1×107 (细胞总数大于1×107 ) 收集细胞 去除培养液 胰酶消化(一般加入2ml 胰酶， 37 oC 充分消化，大约3 分钟, 消化至细胞轻拍脱壁) 加入5ml 培养液中和，充分 分散细胞(尽量使之呈单 细胞悬液,可通过显微镜观察判断) 取100ul 细胞上机，测定转染效率，剩余细胞记数，离心 根据转染效率，分选模式(一般选用exclusion 模式)，调节细胞浓度，达到 上样速率1000-3000 个/秒，目的细胞300 个/秒(细胞浓度(个/ul)=300/目的 细胞百分率) 上机，分选 分选后细胞，1500 转/秒，5min,离心收集细胞 1) 若所要分选的是悬浮细胞，要求细胞总数大于1×107，直接收集细胞液 2) 必需的control：举例说明，如果需要筛选的是GFP 阳性的细胞，必须提供没 有转染的同种细胞。 3) 如果分选后的细胞还需要继续培养，需要预先用无菌的4%BSA 包埋收集管 (在无菌收集管中，加满4%BSA ，并放置于4℃至少1 小时，使用前倒除包 埋液)。 4) 如果分选后的细胞还需要继续培养，所有用到的试剂，包括鞘液，都必须无 菌处理；在分选前及分选过程中，必须进行严格无菌操作，机器需要经过酒 精冲洗，无菌PBS 冲洗的过程。 5.2 分选细胞的上机操作程序 5.2.1 上机分选前准备 第七章 流式细胞分析分选术 53 1)无菌分选 分选前夜FACS 仪器间需紫外照射过夜，收集管预先用4%BSA 包埋(4 ℃至少1 小时) 分选前冲洗机器程序：1. 将上样管换成75%酒精，鞘液 桶中换成3L 75%酒精冲洗，至3L 酒精完全跑完； 2. 倒去鞘液桶中残余的酒精， 用无菌PBS 冲洗鞘液桶使酒精彻底去除，加无菌PBS 至鞘液桶满，同时上样管 中换成无菌PBS，冲洗，使每个收集管收集液体约20ml 左右,即可上机分选。 2)非无菌分选 如果不需要无菌分选，可仅用少量酒精冲洗，再用PBS 冲洗至每管收集约 20ml 后即可上机分选。 5.2.2 上机分选步骤 打开cellquest 软件，先上control 样本，确定细胞获取条件，并划定需要获 取的细胞范围；在Acquire menu 菜单下，选择SortSetup，并设定SortSetup 下的 一系列参数，设定完毕，Acquire,上样分选。 注：SortSetup 下主要的参数设定如下： SortGate 选择分选门，SortCount 选择0(连续分选)， SortMode 选择分选模式(一般使用exclusion) *须知：分选完毕后，用水冲洗，使每个收集管收集液体约20ml 左右后可停止(防 止分选管道中形成盐结晶)。继而用常规冲洗方法冲洗上样管。 5.3 相关试剂的配制 1．4%BSA 溶液:使用1×PBS 作为溶剂,每100ml 1×PBS 中加入4gBSA,充分溶 解. 2．1×PBS 溶液:采用GIBCO 1×10L D’PBS(Cat.No21600-069)配制。 |
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