应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 平末端连接，连上了，很多转化子中没有一个正确的，怎么办？
52/1返回列表
查看: 2328  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

zld629

木虫 (小有名气)

[求助] 平末端连接，连上了，很多转化子中没有一个正确的，怎么办？

在构建一个载体到了最后一步平末端连接，总是不成功。转化后长了不少菌，挑了100多那个，几乎整板都挑了，没有一个对的。怎么办？我用载体上片段做正引物、插入片段末端做反引物，做PCR，连接液有很亮的带，应该是有连上的了，为什么转化子中却没有？如何解决这个问题呢？
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2012-06-24 19:24:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zld629

木虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by chan_6217911 at 2012-06-26 10:04:42
载体用pMEI处理后有没有进行去磷酸化处理，单酶切容易造成载体自连

去磷酸化的做过，长不出来。不去磷酸化再加点pmei的也做过，这回只长几个菌，然而也不是。
感谢各位的热心帮助！我再试试吧。谢谢！
赞一下 回复此楼
12楼2012-06-26 15:39:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答

zld629

木虫 (小有名气)
补充一下：我的载体是用PMEI酶切的，片段是用高保真PCR的；也试过连接液中加入PMEI,长了7个菌，以为是的了，结果一PCR验证，还不是。都做了两个月了，崩溃中
赞一下 回复此楼
2楼2012-06-24 19:40:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chen.qiqi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，很热心哦 2012-06-25 13:44:46
有可能是把载体转化进去的那一步操作不好，温度时间没有控制好。
也有可能选的菌比较难转化成功，毕竟转化的成功率一般都低。
你可以这么试试，结合载体的类型和大小，选用另外一种公认容易转化成功的菌，试试能不能转进去。如果能转进去，说明你之前的菌较难转化。如果不能转进去，说明载体其实没有链接好或者操作过程有问题。
赞一下 回复此楼
3楼2012-06-25 00:25:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

陈帅印

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-25 13:44:56
先加A连接到t载体上，鉴定后酶切，再连接到目的载体上。实在不行试试In-Fusion克隆技术。http://wenku.baidu.com/view/5bb2f4a70029bd64783e2c60.html?st=1
赞一下 回复此楼
4楼2012-06-25 11:25:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭