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lockye

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[资源] 抗血清的纯化方法

抗血清的纯化
(Purification of antiserum)
抗血清纯化的目的是尽量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分，以防止抗体外的其他血清成分对试验结果产生影响。因此只能根据不同目的的要求，从抗血清中除去容易干扰的有关成分，或提取相应的免疫球蛋白。
抗血清纯化的方法主要有粗提法和精制法两个过程。粗提法主要常用硫酸铵盐析法，精制法分非特异性和特异性两种类型。非特异性方法如葡聚糖凝胶过滤法、离子交换层析法，其方法均系基于蛋白质分子的物理性质。特异性方法如免疫吸附法，其方法基于抗原抗体的特异性反应。
一、盐析法
(Salt fractionation)
【实验原理】
蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同，血清γ球蛋白在一定浓度盐溶液中易于沉淀，而白蛋白则不易沉淀，据此可将二者分离。
【主要试剂与器材】
1.饱和硫酸铵溶液  取500ml蒸馏水加热至70～80℃，将400g硫酸铵溶于其中，搅拌20min，冷却。待硫酸铵结晶沉于瓶底，其上清即为饱和硫酸铵。在使用前用28%氨水调pH7.0。
2.兔血清(含抗体)。
3.透析袋、离心机等。
【操作方法】
1.用55%饱和硫酸铵提取血清中β、γ球蛋白
⑴血清1份加生理盐水1份混匀,然后逐滴加入饱和硫酸铵2份中,边加边搅拌,防止形成团块降低沉淀物的特异性.混匀后静置30min或置4℃冰箱过夜。
⑵低温高速10 000/min离心10min，将上清液(含白蛋白)弃去，取沉淀物(含球蛋白)溶于少量生理盐水中。
2.用33%饱和硫酸铵提取γ球蛋白
将上述提取物生理盐水溶液2份加1份饱和硫酸铵。然后再10 000/min离心，其余操作同上。
3.按同样方法用33%饱和硫酸铵再提取1次。
4.将提取物装入透析袋，在生理盐水中透析，以除去其中所含的硫酸铵。放-20℃冰箱保存。
【结果判断】
用双向免疫扩散法和免疫电泳法检测抗体活性、效价和纯度。
【注意事项】
1.用于盐析的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸盐等，最常用的是硫酸铵，因为硫酸铵饱和溶液所含盐浓度很高，溶解度受温度影响小，一般不引起蛋白质变性，但不纯的硫酸铵含重金属，会影响蛋白质生物活性，故应用分析纯试剂。
2.中性盐浓度  不同浓度硫酸铵，当达到20%饱和度时，可沉淀血浆中纤维蛋白原，增加饱和度至28%～33%，可使优球蛋白析出，当饱和度大于50%则可析出白蛋白。
3.pH  当溶液pH调至蛋白质的等电点，使所带阳电荷与阴电荷相等时，易使蛋白析出。球蛋白等电点为pH5～8。
4.蛋白质浓度  如血清蛋白的浓度自0.5%递增至3%时，所需中性盐饱和度的最低极限度可从29%递减至24%，但当蛋白质浓度增高后，蛋白质的共沉作用也增加，影响蛋白质纯化，故当溶液内蛋白质浓度过高，可做适当稀释，一般认为2.5%～3.0%的蛋白浓度较好。
5.温度  盐析蛋白时温度要求并不严格，一般在室温(25℃)比在0℃时更易析出，除非盐析对温度敏感的蛋白质(如抗体)要求在4℃进行。
6.透析除盐  透析液内NH4+的检测可用纳氏试剂，如产生黄色沉淀证明NH4+的存在。
【应用与评价】
经盐析法提取的蛋白质为粗提的免疫球蛋白，若要获得纯化的免疫球蛋白，必须经凝胶过滤或离子交换层析提纯。
【思考题】
1.盐析法粗提免疫球蛋白的原理是什么？
2.盐析法粗提免疫球蛋白有哪些注意事项？
二、凝胶过滤法
(Gel filtration)
【实验原理】
利用具有分子筛效应的多孔网状凝胶做为介质，可分离提纯分子量不同的大分子物质。在凝胶过滤过程中，分子量大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间空隙先流出凝胶柱外；分子量小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢而最后流出柱外，这样就能将分子量不同的物质分离。
【主要试剂与器材】
1.待提纯样品。
2.Sephadex G-200。
3.2.5×100mm层析柱。
4.洗脱液  0.01mol/L pH7.2～7.4PBS(含0.14mol/L NaCl)。
5.751紫外分光光度计。
【操作方法】
1.处理凝胶  将Sephadex G-200用蒸馏水竟充分膨胀后进行浮选。
2.装柱  在层析柱底部铺加一层尼龙纱，然后将洗脱液和凝胶粒子沿插入柱底的玻璃棒缓缓倾注于层析柱内。
3.加样  在凝胶柱表面再加一层尼龙纱，沿管壁缓缓加入样品，所加样品体积不超过凝胶柱的10%。
4.洗脱  洗脱液洗脱，流速20ml/h。待样品洗脱下来(用20%磺基水杨酸检测)即用试管分段收集。
5.检测  在紫外分光光度计上测定各管样品的A280nm值。
【结果判断】
以A280nm值为纵轴，收集管次序为横轴，绘出各洗脱峰，并分别收集各峰的洗脱液，再分别进行蛋白质定量与性质和纯度的鉴定。用已知标准抗体，采用双向琼脂扩散试验、免疫电泳法鉴定蛋白质性质和纯度。
【注意事项】
1.膨胀凝胶时，需将凝胶干粉慢慢加入到盛有10倍水的烧杯内，边加边用玻璃棒轻轻搅动，待被浸泡膨胀的凝胶粒沉下，倾去上层水份及内含的细颗粒，换蒸馏水数次，浸泡过程搅动要温和轻慢，以免损坏凝胶颗粒，装柱前一定要达到充分膨胀并换洗脱缓冲液(PBS)再平衡，换PBS 2～3次，待装柱用。
2.一般常用的洗脱缓冲液pH和离子强度以能使样品稳定为原则。血清蛋白成分的分离纯化，多采用pH6.9～8.0之间磷酸盐缓冲液或pH8.0 Tris-HCl缓冲液。
3.样品洗脱结束后，凝胶即已再生。依次装柱可反复使用多次。凝胶悬液加防腐剂后于4℃冰箱内可保存数月。
【应用与评价】
凝胶过滤法广泛应用于生物高分子的蛋白质、酶、核算等的分离和提纯；凝胶过滤法还可用来测定蛋白质分子量，需取已知分子量样品作为标准对照；血清中存在异常免疫球蛋白，经凝胶过滤得到与正常人不同的峰形。
【思考题】
凝胶过滤法纯化抗体的原理是什么？
三、离子交换层析法
(Ion exchange chromatography)
【实验原理】
离子交换层析是从血清包括抗血清中分离纯化IgG的重要方法。它是利用带电离子的纤维素(如DEAE纤维素)，吸附带相反电荷的蛋白质，又因各种蛋白质的等电点不尽相同，在一定pH条件下，所带电荷量不等，与纤维素结合的能力有别。当用pH7.4磷酸缓冲液(PB)洗脱时，人血清蛋白中IgG所带电荷最少，与纤维素结合最差，故最先被洗脱下来，从而可达到分离纯化目的。
【主要试剂与器材】
1.蒸馏水、0.5mol/L NaOH、0.01mol/L pH7.4 PBS、20%三氯醋酸。
2.混合正常人血清、DEAE纤维素。
3.层析柱、烧杯、pH试纸。
【操作方法】
1.用蒸馏水浸泡适量DEAE纤维素过夜，除去飘浮物，再用0.5mol/L NaOH浸泡30min，反复用蒸馏水洗，可用2 000r/min离心或布氏漏斗抽滤分离，直到洗至约pH7.4，用0.01mol/L pH7.4 PBS再洗一次后装柱。
2.用相同的PBS平衡至pH7.4，当柱上端的PB液凹面与纤维素相切时，加入一定量的血清，待血清渗入柱内与柱面相切时，立即沿管壁加少量洗脱液至形成1cm液层后，用0.01mol/L PBS洗脱，控制流速为1ml/min。
3.分管收集,每管吸取少量洗脱液，加20%三氯醋酸测蛋白，合并、保留蛋白含量较高的洗脱液。
4.将含IgG的洗脱液装入透析袋内，用蔗糖或大分子聚乙二醇包埋过夜，水份析出，袋内IgG被浓缩。IgG可短期保存于4℃冰箱中备用。
【结果判断】
用单向免疫扩散试验测定浓缩液IgG含量，用抗人全血清作免疫电泳测定纯度，如纯化成功，应只在IgG部位出现沉淀线。
【注意事项】
1.纤维素装柱时，不能出现断层、气泡，柱面要平整。
2.缓冲液平衡要充分。
3.加血清量不宜过多。
【应用与评价】
该方法是目前最广泛应用的高分子物质提纯方法之一。总IgG或特异性IgG均可用本法纯化。纯化的IgG杂蛋白少，可做为免疫原、包被用抗体或用标记物标记。
【思考题】
离子交换层析纯化IgG的原理是什么？
　
附  单克隆抗体制备简介
目前，商品单克隆抗体已有数百种, 常规使用的单抗试剂盒已广泛地用于病原体(病毒、细菌、寄生虫) 、肿瘤标志物、激素、自身抗体、细胞表面抗原等的检测。全国单抗诊断试剂年市场不低于10亿元。治疗用单抗正在进一步开发中。现在厂家或试剂公司除提供单抗试剂盒外，提供的单抗和标记的单抗，一般是小量分装的, 标明有特异性、类型、效价、用途、规格和价格等。
单克隆抗体是用杂交瘤技术生产的。其制备包括两个主要步骤：
(一)杂交瘤细胞的制备
用于生产单克隆抗体的杂交瘤是能分泌特定抗体的、能在体外长期生长的、单个细胞形成的细胞系(克隆)。其简要制备过程如下：
1.亲本细胞  ①免疫脾细胞：抗原免疫Balb/c小鼠，取其脾细胞制成悬液；②骨髓瘤细胞：不产生Ig，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)阴性。
2.杂交  少量浓集的亲本细胞混合，缓慢加入聚乙二醇(PEG 1000)，稍后加营养液稀释。
3.选择  用HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷)培养液将细胞分散后进行培养。
4.检测  用血清学方法(多用ELISA法)检测有细胞生长的培养上清液, 寻找能产生所需抗体的细胞。
5.克隆  将能产生所需抗体的细胞充分稀释至每孔一个细胞后进行培养。
6.再检测  再用血清学方法检测培养上清液，寻找能产生所需抗体的细胞。
克隆、检测可反复进行，直至确认所需抗体为单个细胞的后代，即单一克隆所产生分泌。
7.保存  用液氮保存能产生所需抗体的杂交瘤细胞。
(二)单克隆抗体生产
用杂交瘤细胞大量生产所需的单克隆抗体。具体方法如下：
1.从液氮中复苏杂交瘤细胞, 制成悬液。
2.将杂交瘤细胞注入一周前曾注射过液体石蜡等刺激物于腹腔中的Balb/c小鼠腹腔中。
3.1～2周后收获腹水，离心取上清液。纯化鉴定后分装、保存。

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