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dajiong金虫 (正式写手)
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[求助]
构建克隆载体时出现的问题
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| 从蓝白筛选过的平板上挑了三个阳性单克隆，摇菌过夜，第二天分别取菌液用PCR鉴定，发现只有一个出来了目的片段（1000bp左右的）。还有一个有片段但是只有500bp，还有一个压根没有目的片段……胶什么的都没问题，想知道是在哪一步出了问题。谢谢！ |
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12楼2012-05-25 09:00:40
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-24 13:53:24
dajiong: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-05-24 21:40:12
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dajiong: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-05-24 21:40:12
| 我们实验室就一直在做这个，蓝白筛选平板上不一定全部都是阳性克隆，存在很多假阳性，所以会出现有的有目的片段，有的有插入片段但不是目的片段，或者有的压根就没有片段插入，你这个情况很正常。我们的做法是先放在4℃冰箱数个小时，假阳性就可以表现出来，但是也不能完全避免这种情况，进一步菌落PCR还是会有没有目的片段的现象。只要有一个克隆出来了就行，留一部分养着，另一部分拿去测序，就能确定克隆序列是否正确了。 |
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dajiong2楼2012-05-24 13:27:42
hyacinth326
金虫 (正式写手)
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3楼2012-05-24 14:00:25
jasonwyb123
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4楼2012-05-24 15:02:12