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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于RNA反转录
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梦-妖精

铁虫 (初入文坛)

[求助] 关于RNA反转录

我们实验反转录的试剂盒是Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）TaKaRa 宝生物工程（大连）有限公司  里面只有5xM-MLV Buffer和RTase M-MLV(RNase H-)这两种试剂，其他的Oligo(dT)和dNTP Mixture都没有，我们之前有个别的试剂盒，里面有这两样，但是后面的（μM)不一样，这样反转录的还可以吗？？？比如，要求的Oligo(dT)12-18 Primer (50μM),而我有的只是10μM，前者加一微升，后者加5微升，就一样了吗？？？还是怎么样子？最后真的有必要检测cDNA吗，好茫然啊~（提取的是两栖类的RNA，质量还可以，有明显的两条带）
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1楼 2012-05-23 11:06:40
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梦-妖精

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by longrna at 2012-05-29 10:50:25
有关随机引物加的量问题，不同的公司加的量都不一样。
可能有的公司50uM的加1ul，也有100uM的加1ul，也有20pM/ul加1ul的，关键看你参考哪个公司的。

不是，开始我们有个试剂盒，就是酶用光了，后来买的这个反转录试剂盒，里面就有两样试剂，别的都没有，没办法我才用第一个试剂盒里剩下的东西，不过第二个试剂盒里用的试剂，要求了50μM加1微升，但是我只有10μM的，开始没注意，也就加了一微升，不知道有没有关系~
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13楼2012-05-30 12:59:50
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助，今天很有空哦 2012-05-23 14:08:51
嗯.....................
       当然可以啊 10uM多加4倍体积就成了50uM啦
       没有必要检测cDNA 因为普通方法你也没法检测 如果不放心参照某些文献设计引物做3‘/5’完整度实验这是通用的检测cDNA方法
       个人看法 若有说错请高手指点
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Let God do with it as He wills
2楼2012-05-23 12:53:39
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梦-妖精

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-23 12:53:39:
嗯.....................
       当然可以啊 10uM多加4倍体积就成了50uM啦
       没有必要检测cDNA 因为普通方法你也没法检测 如果不放心参照某些文献设计引物做3‘/5’完整度实验这是通用的检测cDNA方法

可是那样的话，整个体积就又变了啊，完全和试剂盒里要求的体积不一样了，那样会有影响吗？？？
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3楼2012-05-23 14:59:56
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-05-23 20:51:38
检测cDNA，可以用Q3000测下浓度与吸光度值嘛。反转录的时候注意灭火一下就可以了，楼上已经回答的很详细了，个人感觉不必拘泥于试剂盒说明书剂量，体系的选择有可能要在试剂盒的基础上做改变的
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4楼2012-05-23 17:28:48
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