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tiancailijia

金虫 (正式写手)

[交流] 请问有没有人做小肠的组织切片

请问有没有人做过小肠的组织切片，石蜡及冰冻切片的，求具体的步骤，大家给点意见吧

[ Last edited by xinmor on 2012-5-22 at 11:10 ]
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1楼 2012-05-21 11:14:01
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692785744

木虫 (正式写手)
★
tiancailijia(金币+1): 谢谢参与
病理石蜡切片的制作包括石蜡组织块制作、切片制作和染色。
其制作过程是：取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→烤片→脱蜡→复水→染色→脱水→透明→封藏。
（一）石蜡组织块制作
１、取材和固定：
固定的目的在于保存组织内细胞原有的结构和形态，使其与生活时相似，因此要求固定的材料越新鲜越好。处死动物后应立即切取组织块，组织块的大小以厚度不超过５mm为宜，并快速投入固定液中。固定液有10％甲醛溶液、Bouin氏固定液、FAA固定液等。固定时间为数小时至２４小时（需视组织块的大小而定）。
2、冲洗：
经固定的材料，可根据不同的固定液，分别用水或酒精冲洗，以洗去固定液，否则固定液留在组织会有碍染色。
3、脱水：
　  柔软并含有多量水分的组织是易切成薄片的，故必须增加组织的硬度。石蜡切片法就是使石蜡渗入组织，以达到支持增硬的作用。但水与石蜡是不相混合的，因此，在浸蜡、包埋前须将组织中的水分完全除去，这一步骤即为脱水。
　  常用的脱水剂是酒精。脱水时，先从低浓度的酒精开始，然后，递增浓度，直至无水酒精。具体方法是，将材料经30%--50%--７０％酒精→８０％酒精→90%--９５％酒精（Ⅰ）→９５％酒精（Ⅱ）→无水酒精（Ⅰ）→无水酒精（Ⅱ），各级酒精１－２小时。小的组织每级脱水时间30-40min就可以。否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。
注意：在低浓度酒精中和高浓度酒精中都不能时间太长，要过夜，就在70%酒精中。长时间在低浓度酒精中容易使材料解体降解。长时间在高浓度酒精中容易使组织变脆。
４、透明：
酒精与石蜡不能混和，因此，脱水后的材料在浸蜡前，还必须经过透明。透明剂既可替代组织中的酒精，又能溶解石蜡，以利石蜡的渗入。二甲苯是常用的一种透明剂。
将脱水后的材料经１：１无水酒精与二甲苯→二甲苯（Ⅰ）→二甲苯（Ⅱ），各级时间为０.５－２小时，务使组织达到透明为止。小的组织每级15-30min就可以。
注：若在二甲苯中组织周围出现雾状，说明脱水不彻底，要返回脱水至完全再透明。
５、浸蜡：
　将已透明的材料移入熔化的石蜡内浸渍即为浸蜡。其目的是去除组织中的透明剂，而使石蜡渗入整个组织，获得一定的硬度和韧度，以便切成薄的切片。
先将装有５６－５８℃石蜡的三个蜡杯放在熔蜡箱内熔化，并使熔蜡箱的温度保持恒定（约５８℃），切勿太高或太低。然后将透明了的材料放入石蜡与二甲苯1：1的蜡杯（Ⅰ）→石蜡（Ⅱ）→石蜡（Ⅲ）。浸蜡时间视材料大小而定，一般总的浸蜡时间为２－４小时左右。
小的组织每步20-30min就可以。
石蜡要至少溶2次，才会韧性比较好。好的石蜡有助于切片。
６、包埋：
　将浸蜡后的材料包埋于石蜡中，并使它凝固成蜡块，这一过程称为包埋。
　包埋常用铜制包埋框，将已熔化的石蜡倒入，随即将已浸蜡的材料放入其中，应注意切面朝下，位置放正。待石蜡全部凝固后，推出蜡块。
我们用的是小模具，如果大点的组织，就需要大的模具，或者做成大的石蜡包埋块。
7 切片
  切片时，最重要的是刀片要好，温度合适。温度太高容易卷片，皱片。
  所以气温高时，要将包了组织的石蜡块放冰上，或四度冰箱冷却再切。或开空调降温。
8 展片 水温在37-40度。
9 贴片 烤片
  一般在37度过夜，或者65度一小时
  对于抗原性比较弱的，最好是37度过夜。
10 脱蜡复水
   将烤好的片放入二甲苯（Ⅰ）二甲苯（Ⅱ）各5-10min脱蜡
   100%酒精（Ⅰ）（Ⅱ）--95%--90%--80%—70%酒精各3-5min
   PBS中三次，每次3-5min
11 做组化或染色





固定的注意事项 1).固定液的用量   固定液的用量一般为组织块体积的20倍左右,并考虑组织块内所含水分对固定液浓度的影响 2).固定液的配制   应尽量使用新鲜配制的固定液,以现配现用最为理想. 3).固定的时间   固定的时间应视组织块的大小,部位,性质,种类固定液的性质,渗透力,以及固定时的温度而确定.一般情况下固定24h即可达到固定要求
固定液 (一)单纯固定液 1).甲醛(formaldehyde)  固定浓度  10%~20%水溶液  固定时间  12~24h 2).乙醇(ethyl alcohol)  固定浓度  80%~90%  固定时间  依组织块大小和乙醇浓度而定一般4~12h 3).冰乙酸(acetic acid)  固定浓度  2%~5%  固定时间  很少单独使用 4).升汞(mercury bichloride)  固定浓度  5%~7%水溶液  固定时间  不超过24h 5).苦味酸(picric acid)  固定浓度  饱和水溶液  固定时间  不超过24h 6).重铬酸钾  固定浓度  1%~3%水溶液  固定时间  24h至数天 7).丙酮(acetone)  固定浓度  原液  固定时间  冷固定(4度2~8h) 8).铬酸  固定浓度  0.5%~1%  固定时间  24h  9).四氧化锇  固定浓度  1%~2%双整水溶液  固定时间  24h
(二)混合固定液 1).中性甲醛 配制方法 40%甲醛120ml,蒸馏水880ml,磷酸二氢钠4g,磷酸氢二钠13g 固定时间 24h 适用组织 实验室常备固定液,适用于多种组织的固定 2).乙醇-甲醛液(a-f液) 配制方法 95%乙醇90ml, 40%甲醛10ml 固定时间 组织块固定4~12h,铺片固定5~10min 适用组织 皮下组织中的肥大细胞,组织化学中的对糖原的固定等 3).bouin氏液 配制方法 苦味酸水溶液75ml, 40%甲醛25ml,冰乙酸5ml 固定时间 12~24h 适用组织 实验室常备固定液,特别适用固定皮肤组织 4).苦味酸-硫酸液 配制方法 饱和苦味酸水溶液100ml,硫酸2ml 固定时间 2~4h  适用组织 胚胎组织 5).carnoy液 配制方法 冰乙酸10ml,氯仿30ml,无水乙醇60ml 固定时间 20~40min,较大组织块不超过2~4h 适用组织 糖原,染色体和尼氏体  
6).helly氏液 配制方法 重铬酸钠2.5g,升汞5g,蒸馏水100ml,使用时去上液95ml加入40%  甲醛5ml 固定时间 12~24h  适用组织 骨髓,脾,肝等  7). altmann氏液 配制方法 5%重铬酸钠10ml,2%锇酸水溶液10ml用时配 固定时间 24h 适用组织 脂肪组织,线粒体,神经细胞 8).verhoeff氏液 配置方法 40%甲醛10ml,95%乙醇48ml,蒸馏水36ml,苦味酸  1g 固定时间 48h  适用组织 眼球 9).zenker氏液 配制方法 重铬酸钠2.5g,升汞5g,冰醋酸5ml,蒸馏水100ml 固定时间 24h  适用组织 实验室常备固定液,适用于多种组织的固定

二、石蜡切片
    石蜡切片不仅是常规病理中的重要切片形式，也是免疫组化研究中较常用的切片形式，它能满足免疫组化的连续切片要求。为了便于染色及观察，切片时应注意：①连续切片时应按顺序分离及贴片，不应颠倒；②贴片时应距载玻片一端至少1cm，一般靠一边，以利于显色安全；③用于免疫组织化学染色的蜡温应为56—58℃，切片水温在40℃左右，应先置于冷水中，然后再移人热水中，这样可以使切片能顺利展平；④切片刀要求快，切片要薄，无刀痕和皱褶，在染色时可减少非特异染色；⑤烤片时要注意，抗原性较强的组织可在60℃烤3—8h，抗原较弱的组织可于37℃恒温箱内过夜；⑥切片如需长期保存，可置于4℃或室温下，千万不可脱蜡后4℃保存，因脱蜡后失去了对抗原决定簇的保护。
1．铬矾明胶液
　　试剂：铬矾　　　　　　　　0.5g
　　明胶（Gelatine）　　　　　5g
　　H2O　　　　　　　　　　 ~1000ml
　　方法：在1000ml的烧杯或烧瓶中，以500～800ml H2O加温溶解明胶，待其完全溶解后，再加入铬矾。注意温度过高易使明胶烧糊，包被玻片时最好控制水温在70℃。如有明显残渣，过滤后使用。
2．甲醛-明胶液
　　试剂：40%甲醛　　　　　　2.5ml
　　明胶　　　　　　　　　　0.5g
　　蒸馏水　　　　　　　　　至100ml
　　配制方法：用少许蒸馏水（约80ml）加热溶解明胶，待完全溶化后，加入甲醛，最后补充蒸馏水至100ml混匀即可。
3．多聚赖氨酸（Poly-L-Lycine,PLL）
　　试剂：多聚赖氧酸　　　　　 5g
　　蒸馏水　　　　　　　　　　 ~1000ml
　　配制方法：称取PLL，溶于H2O，充分混合即可，此液浓度为0.5%，可适当稀释配成0.01～0.5%浓度。4℃保存，也可-20℃备用。PLL可反复冰冻，效果无明显影响，工作液常再稀释10～50倍。
4．Vectabond试剂　　该试剂是Vector公司新进推出的一种新型玻片粘附剂。该试剂与一般的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地贴于玻璃片上，贴上后不易脱落，保留时间较久。一个试剂盒（7ml
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11楼2012-05-23 21:18:04
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tiancailijia

金虫 (正式写手)
麻烦各位给点意见好不，每次系统提醒我有人回复可是又没什么实质性意见，给我希望又让我失望啊
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6楼2012-05-21 16:35:55
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lianchen1218

金虫 (正式写手)
★
tiancailijia(金币+1): 谢谢参与
我做了，一般步骤，是先取材，一般大小1.0cm，然后是用福尔马林（一般，看要求还可以用酒精、甲醛固定液）固定，我们实验室一般固定12小时，或者6h都可以了，然后就是脱水，用梯度酒精（-75%-85-95-100-100%，时间都是不同的，100的一共不能够超过过2小时，其他的可以半天左右，或者3小时都可以）脱水，然后透明，用二甲苯（过两次，每次一个小时差不多）透明，透明后侵石蜡（记住石蜡要60度恒温保存，石蜡也要侵至少2次，每次一小时左右吧），过后就是石蜡直接包埋了
冰冻切片的话厚度也要控制在1cm以内，冰冻切片不用包埋，直接切片就可以了，但是也要固定
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7楼2012-05-23 17:02:21
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fgx0168888f

铁杆木虫 (正式写手)
★
tiancailijia(金币+1): 谢谢参与
我没做过，但我找了一篇文献，可能会对你有帮助。下载地址：https://115.com/file/anl0jux7#冰冻切片的制作体会.pdf
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8楼2012-05-23 18:48:50
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