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[交流]
请问有没有人做小肠的组织切片
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请问有没有人做过小肠的组织切片，石蜡及冰冻切片的，求具体的步骤，大家给点意见吧  [ Last edited by xinmor on 2012-5-22 at 11:10 ] |
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6楼2012-05-21 16:35:55
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tiancailijia(金币+1): 谢谢参与
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我做了，一般步骤，是先取材，一般大小1.0cm，然后是用福尔马林（一般，看要求还可以用酒精、甲醛固定液）固定，我们实验室一般固定12小时，或者6h都可以了，然后就是脱水，用梯度酒精（-75%-85-95-100-100%，时间都是不同的，100的一共不能够超过过2小时，其他的可以半天左右，或者3小时都可以）脱水，然后透明，用二甲苯（过两次，每次一个小时差不多）透明，透明后侵石蜡（记住石蜡要60度恒温保存，石蜡也要侵至少2次，每次一小时左右吧），过后就是石蜡直接包埋了 冰冻切片的话厚度也要控制在1cm以内，冰冻切片不用包埋，直接切片就可以了，但是也要固定 |
7楼2012-05-23 17:02:21
8楼2012-05-23 18:48:50
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石蜡包埋切片技术 实验目的： 1、学习石蜡包埋切片技术的基本原理和基本步骤； 2、掌握石蜡包埋切片技术。 实验原理： 大家在生物学实验时，曾经观察过动物组织和植物组织的切片。通过光学显微镜，我们可以观察到细胞内部的结构（例如细胞核、细胞质、肌肉组织的横纹等）、细胞相互间的联系以及组织的构成等。那么，如何来制作这种切片呢？其过程是比较复杂的，我们利用3—4次实验来学习组织切片的制作。 大家知道，我们要在显微镜下研究生物体的内部结构，在自然状态下是无法观察的，因为整个动、植物体大部分都是不透明的，不能直接在显微镜下观察，一定要经过特殊的处理，使要观察的材料先减少它的厚度和体积，使光线能透过才能用显微镜观察。通常应用的有两种方法：一种是非切片法，即用物理或化学的方法将生物体组织分离成为单个细胞或薄片，例如我们在生物学实验曾做过口腔上皮的观察、洋葱鳞茎表皮的观察。这种方法的不足之处在于细胞彼此间相互的联系不一定观察到。另外一种为切片法，即用刀将标本切成薄片。 非切片法比较简单，一学就会，我们这里不作介绍。 切片法也分徒手切片法和切片机切片法。最简单的切片法是将新鲜植物材料直接用刀切成薄片，称之为徒手切片法。切片机切片法是用特殊的切片机来切片，切片的厚度可薄到几个微米。因此，切片机的发明与应用也是细胞学诞生的重要因素。 切片机切组织用的也是刀（切片刀），所要切的组织要有一定的软硬度，如刀切肉（新鲜、冷冻）。但大部分生物材料比较柔软，所以为了能切出薄片，必须先使所切材料有一定的软硬度。一些包埋剂可以达到这个目的，如石蜡，它融化时可渗入到组织内部；凝固时，使整个组织有一定的软硬度，正好能切出很薄的切片，故称为石蜡包埋切片法。另外还有火棉胶包埋切片法（火棉胶做包埋剂）、冰冻切片法（使组织冷冻到一定的硬度）等。其中最常用的切片方法还是石蜡包埋切片法，我们这里重点学习石蜡包埋切片技术。 实验器材： （一）小鼠、小广口瓶、标签、量筒、烧杯、95%酒精、无水酒精、蒸馏水、手术刀、剪刀、镊子、平皿、石蜡块、滤纸、甲醛液、苦味酸、冰醋酸、移液管、洗耳球。 （二）恒温箱、融蜡、纸盒、烫板、支架、酒精灯、火柴、小镊子、滤纸。（擦载玻片、磨刀、液体石蜡）。 （三）手术刀、木板、酒精灯、火柴、锯条、木块、塑料板、切片刀、切片机、毛笔、小镊子、载玻片、蛋白甘油、恒温水浴箱、温度计、大白盘。 实验步骤： 制作小鼠肝、脾、肾、小肠等切片。 1、取材：取材是指从动物或植物体上割取所要观察的组织材料，比如植物的茎、叶，动物的肝脏、小肠等。 取材时应注意以下几点： （1）新鲜：在割取材料时应愈快愈好，否则动植物体的细胞成分、结构及分布等就会发生改变。 （2）防止人为损伤：如生拉硬拽、挤压等，以免出现人为损伤。 （3）大小：0.5 cm × 0.5 cm × 0.2cm。 2、固定：机体死亡或组织离体后，组织细胞由于血液供应停止，即可发生缺氧，导致生物氧化过程停止。相反，细胞内的无氧酵解酶类活跃，使组织内蛋白质、糖、脂肪降解，导致组织发生自溶。另外，组织也可因污染细菌而发生腐败。因此，为了使细胞和组织结构保持生活时的状态，必须进行适当的固定。固定的目的在于保存组织内细胞的形态、结构及其组成，使其与生活时相似。 固定组织的物质——固定剂——具有凝固或沉淀组织蛋白的作用，因此能抑制酵解酶类的活动和细菌的繁殖，从而呈现对组织的固定作用。 固定剂的种类很多，最常见的有乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞和锇酸等8种。各种固定剂对蛋白质、脂肪、糖等作用不同，因此，单一的固定剂不能保存所有的成分，故多用混合固定剂。 各种书籍对固定剂的介绍特别多，如化学性质、固定的原理、固定组织的优缺点等，由于时间的所限，我们这里不作详细介绍，仅介绍几种常见的固定液及其配方和用途。 （1）10%福尔马林液：1份甲醛液 + 9份蒸馏水 市场上出售的甲醛液约含37-40%的甲醛，10%福尔马林液实际上仅含3.7-4.0%的甲醛。 适用范围：各种组织。但是经10%福尔马林液固定的组织，细胞核染色较好，而细胞质染色较差。 处理：组织块一般固定16-24h，长时间亦可，甚至可用来长期保存组织块。短时间固定的组织块不需水洗，可直接转入70%酒精脱水。 （2）Bouin氏液：苦味酸饱和水溶液（1.22%） 75ml （15） 甲醛液 25ml （5） 冰醋酸 5ml （1） 适用范围：各种动物组织及植物组织的根尖，是动物组织良好的固定液。 处理：固定24h，也可在此液长期保存。流水冲洗或不经水洗直接入70%酒精脱水。 （3）Zenker氏液： 甲液：氯化汞（升汞） 5g 重铬酸钾 2.5g 硫酸钠 1g 蒸馏水 100ml 乙液：冰醋酸 5ml 使用前将甲、乙两液混合。 适用范围:为一般动物组织的优良固定液，经其固定的组织，细胞核及细胞质染色颇为清晰。 处理：固定时间为16-24h，然后流水冲洗一夜以洗去氯化汞，再入70%酒精脱水。切片染色前要用碘液除去汞沉淀。 （4）Gendre氏液： 苦味酸饱和酒精液（8.96g/100ml95%酒精） 85ml 甲醛液 10ml 冰醋酸 5ml 适用范围：用于检查动物组织中的糖原（因为糖原溶于水）。 处理：固定3-6h，直接转入95%酒精脱水。 （5）Carnoy氏液： 无水乙醇 60ml 三氯甲烷 30ml 冰醋酸 10ml 适用范围：用于检查动物组织的核酸、糖原等。 处理：固定2-6h，直接转入95%酒精脱水。 还有多种多样的其它固定液。固定液的选择应根据所要固定的材料以及检查的目的而定。 3、冲洗：材料自固定液中取出后，需立即冲洗，使其中所有的固定液全部除去，以妨碍染色。 有些固定液，如10%福尔马林液、Bouin氏液固定的材料，若时间较短的话可不必冲洗。但时间过长亦需冲洗。 冲洗的方法：组织块放在瓶内，胶管插入瓶内接通自来水，瓶口用纱布包住。流水冲洗一夜，即能达到冲洗的目的。 4、脱水：脱水的目的在于使组织中的水分完全除去。因为组织块将来要在石蜡 中包埋，而水和石蜡是不相溶的。必须经过脱水后，才能进入包埋阶段。 常用的脱水剂有乙醇、丙酮、正丁醇等，最常用的还是乙醇。利用脱水剂吸水的特性，在各级浓度脱水剂中逐渐吸取组织中的水分。乙醇脱水的过程一般从70%乙醇开始，经80%、90%、95%、100%（二次）而完成脱水过程。每向后转移前，须先将组织块上的液体用吸水纸吸干，以免影响后续乙醇的浓度。 脱水时应注意：（1）在高浓度或无水乙醇中，每级停留的时间不宜太长，否则可使组织收缩变脆，影响切片；（2）如需过夜，应停留在70%乙醇中，也可长期保存，可防止因时间倒不开而影响后续步骤。 5、透明：脱水后是否可以进入包埋呢？但因脱水剂与石蜡也不相溶，因此在包 埋前，需要一种既能溶于脱水剂又能溶于石蜡的物质——透明剂——来起中间置 换作用。 所以，透明的目的在于使组织中的乙醇或丙酮被透明剂所代替，以使石蜡能很顺利地进入组织中。另外，还能增强组织的折光系数，故称透明剂。 透明剂的种类很多，常用的有二甲苯、甲苯、苯等。二甲苯为最常用的透明剂，二甲苯能溶于醇及醚，亦为石蜡溶剂，但不溶于水，它的透明力很强。 透明过程：一般经过1/2二甲苯-1/2无水乙醇，两次二甲苯。 透明彻底的标准：胃、肠、结缔组织等比较透明；肝、肾、心、肌肉等组织呈暗红色浸油状态，则说明脱水、透明良好。如果组织进入二甲苯30min以后还不变色，或中心有白色，说明水分未脱净，应返回无水乙醇继续脱水。透明这一步至关重要，若透明时间不足，则石蜡进不去，不能切片；若透明时间过长，则使组织收缩变脆、变硬，切片易碎。这一步要靠经验。 6、浸蜡：浸蜡就是将石蜡透入整个组织的过程。 所谓石蜡包埋切片法，是用石蜡来浸透、包埋组织块，再进行切片和染色的 制片方法。 石蜡为最常用的包埋剂，有几种不同熔点的石蜡，通常所用的石蜡的熔点为54-58℃。 浸蜡过程：在60℃的温箱内已融化的石蜡中经两次各1h，使石蜡浸透组织。 浸蜡时注意温度不宜过高，浸蜡时间亦不宜过长，否则会引起组织变硬、变脆，影响切片。 7、包埋：包埋就是被石蜡浸透的组织连同溶化的石蜡，一起倒入一定形状的器皿（如纸盒、平皿）中，然后使其凝固成蜡块的过程。 包埋的过程：（1）折叠纸盒； （2）用酒精灯加热温台及纸盒； （3）往纸盒中倒入溶化的石蜡； （4）放入组织块，切面向下，并拨正位置； （5）蜡块凝固。 从取材到包埋是一个连续的过程，往往连续几天，如果没有计划、没有完善的安排，就有可能和其他上课时间发生冲突，或造成半夜出勤。有时单凭记忆，把前后顺序颠倒或超过了规定时间，会造成实验失败。因此需预先编制一个日程表。 注意事项：（1）动作要迅速；（2）融蜡别滴到桌面、地上。 8、切片：在包埋后，就可以进行切片。在切片之前，还需对包埋好的组织块进行修整，并贴附于木块上，才能进行切片。 修块：以每一组织块为单位，用小刀将组织块大体修成长方形或梯形，组织的周围须留1-2mm宽的蜡边。 固着：用酒精灯烧热金属片，将组织块切面的对立面稍烫熔一下，并立即贴于木块上。 切片机的构造： 切片机是用来做各种组织切片的一种仪器，其样式很多，性能也不一样，一般可分为两大类型，即滑行式切片机与旋转式切片机。我们使用的是旋转式切片机。其主要结构分为3部分：（1）控制切片厚度的微动装置；（2）供装置切片刀的夹刀部分；（3）供装置组织块的夹物部分。旋转轮每旋转一次，微动装置就按所调节好的切片厚度以水平方向将组织块向前推进一片的厚度。 切片操作： （1）固定切片刀：刀刃向上，保持水平。调好角度，一般在4-6度。 （2）固定组织块。 （3）调整所需要的切片厚度：一般在6-10微米。 （4）移动持刀器，或拔开齿轮上的牵引钩，前后转动齿轮以移动组织块固定器，调节组织块表面和刀刃的距离，以刚要接近时为止。 （5）调整组织块与刀刃之间的角度和位置：组织块的切面及上下边须与刀刃平行。 （6）粗切：右手摇轮，左手转动齿轮，慢慢将组织块切到组织本身。 （7）切片：右手转动摇轮，转一圈可切下一片，切第二片与第一片连在一起，即成连续切片。左手用镊子或毛笔提起切片的下端，轻轻向自身方向拽，使切片成连续的带状。 （8）展片：停止切片，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带跳起，靠刀刃的一面向下，慢慢接触40-45℃的水面，借助水的表面张力使其在水面展开。如有小的皱褶，用小镊子轻轻分开。应注意：水温过高，易使切片全部融化；水温过低，切片不宜伸展。 （9）贴片：即将切片贴在载玻片上。先将连续切片分成一片或小段。将载玻片1/2处均匀涂一层薄薄的蛋白甘油（等量的鸡蛋清和甘油混合而成，防止脱片。切勿涂得过多！），将载玻片垂直插入水中，以涂有蛋白甘油的面贴近组织片，提起载玻片使组织片贴附在载玻片上。用小镊子将切片摆在载玻片1/3和2/3的交界处，并摆正位置。然后在52-60℃恒温箱烤干。 整个石蜡包埋切片技术至此全部结束。 |
9楼2012-05-23 18:53:18
10楼2012-05-23 19:21:47
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病理石蜡切片的制作包括石蜡组织块制作、切片制作和染色。 其制作过程是：取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→烤片→脱蜡→复水→染色→脱水→透明→封藏。 （一）石蜡组织块制作 １、取材和固定： 固定的目的在于保存组织内细胞原有的结构和形态，使其与生活时相似，因此要求固定的材料越新鲜越好。处死动物后应立即切取组织块，组织块的大小以厚度不超过５mm为宜，并快速投入固定液中。固定液有10％甲醛溶液、Bouin氏固定液、FAA固定液等。固定时间为数小时至２４小时（需视组织块的大小而定）。 2、冲洗： 经固定的材料，可根据不同的固定液，分别用水或酒精冲洗，以洗去固定液，否则固定液留在组织会有碍染色。 3、脱水： 柔软并含有多量水分的组织是易切成薄片的，故必须增加组织的硬度。石蜡切片法就是使石蜡渗入组织，以达到支持增硬的作用。但水与石蜡是不相混合的，因此，在浸蜡、包埋前须将组织中的水分完全除去，这一步骤即为脱水。 常用的脱水剂是酒精。脱水时，先从低浓度的酒精开始，然后，递增浓度，直至无水酒精。具体方法是，将材料经30%--50%--７０％酒精→８０％酒精→90%--９５％酒精（Ⅰ）→９５％酒精（Ⅱ）→无水酒精（Ⅰ）→无水酒精（Ⅱ），各级酒精１－２小时。小的组织每级脱水时间30-40min就可以。否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。 注意：在低浓度酒精中和高浓度酒精中都不能时间太长，要过夜，就在70%酒精中。长时间在低浓度酒精中容易使材料解体降解。长时间在高浓度酒精中容易使组织变脆。 ４、透明： 酒精与石蜡不能混和，因此，脱水后的材料在浸蜡前，还必须经过透明。透明剂既可替代组织中的酒精，又能溶解石蜡，以利石蜡的渗入。二甲苯是常用的一种透明剂。 将脱水后的材料经１：１无水酒精与二甲苯→二甲苯（Ⅰ）→二甲苯（Ⅱ），各级时间为０.５－２小时，务使组织达到透明为止。小的组织每级15-30min就可以。 注：若在二甲苯中组织周围出现雾状，说明脱水不彻底，要返回脱水至完全再透明。 ５、浸蜡： 将已透明的材料移入熔化的石蜡内浸渍即为浸蜡。其目的是去除组织中的透明剂，而使石蜡渗入整个组织，获得一定的硬度和韧度，以便切成薄的切片。 先将装有５６－５８℃石蜡的三个蜡杯放在熔蜡箱内熔化，并使熔蜡箱的温度保持恒定（约５８℃），切勿太高或太低。然后将透明了的材料放入石蜡与二甲苯1：1的蜡杯（Ⅰ）→石蜡（Ⅱ）→石蜡（Ⅲ）。浸蜡时间视材料大小而定，一般总的浸蜡时间为２－４小时左右。 小的组织每步20-30min就可以。 石蜡要至少溶2次，才会韧性比较好。好的石蜡有助于切片。 ６、包埋： 将浸蜡后的材料包埋于石蜡中，并使它凝固成蜡块，这一过程称为包埋。 包埋常用铜制包埋框，将已熔化的石蜡倒入，随即将已浸蜡的材料放入其中，应注意切面朝下，位置放正。待石蜡全部凝固后，推出蜡块。 我们用的是小模具，如果大点的组织，就需要大的模具，或者做成大的石蜡包埋块。 7 切片 切片时，最重要的是刀片要好，温度合适。温度太高容易卷片，皱片。 所以气温高时，要将包了组织的石蜡块放冰上，或四度冰箱冷却再切。或开空调降温。 8 展片 水温在37-40度。 9 贴片 烤片 一般在37度过夜，或者65度一小时 对于抗原性比较弱的，最好是37度过夜。 10 脱蜡复水 将烤好的片放入二甲苯（Ⅰ）二甲苯（Ⅱ）各5-10min脱蜡 100%酒精（Ⅰ）（Ⅱ）--95%--90%--80%—70%酒精各3-5min PBS中三次，每次3-5min 11 做组化或染色 固定的注意事项 1).固定液的用量 固定液的用量一般为组织块体积的20倍左右,并考虑组织块内所含水分对固定液浓度的影响 2).固定液的配制 应尽量使用新鲜配制的固定液,以现配现用最为理想. 3).固定的时间 固定的时间应视组织块的大小,部位,性质,种类固定液的性质,渗透力,以及固定时的温度而确定.一般情况下固定24h即可达到固定要求 固定液 (一)单纯固定液 1).甲醛(formaldehyde) 固定浓度 10%~20%水溶液 固定时间 12~24h 2).乙醇(ethyl alcohol) 固定浓度 80%~90% 固定时间 依组织块大小和乙醇浓度而定一般4~12h 3).冰乙酸(acetic acid) 固定浓度 2%~5% 固定时间 很少单独使用 4).升汞(mercury bichloride) 固定浓度 5%~7%水溶液 固定时间 不超过24h 5).苦味酸(picric acid) 固定浓度 饱和水溶液 固定时间 不超过24h 6).重铬酸钾 固定浓度 1%~3%水溶液 固定时间 24h至数天 7).丙酮(acetone) 固定浓度 原液 固定时间 冷固定(4度2~8h) 8).铬酸 固定浓度 0.5%~1% 固定时间 24h 9).四氧化锇 固定浓度 1%~2%双整水溶液 固定时间 24h (二)混合固定液 1).中性甲醛 配制方法 40%甲醛120ml,蒸馏水880ml,磷酸二氢钠4g,磷酸氢二钠13g 固定时间 24h 适用组织 实验室常备固定液,适用于多种组织的固定 2).乙醇-甲醛液(a-f液) 配制方法 95%乙醇90ml, 40%甲醛10ml 固定时间 组织块固定4~12h,铺片固定5~10min 适用组织 皮下组织中的肥大细胞,组织化学中的对糖原的固定等 3).bouin氏液 配制方法 苦味酸水溶液75ml, 40%甲醛25ml,冰乙酸5ml 固定时间 12~24h 适用组织 实验室常备固定液,特别适用固定皮肤组织 4).苦味酸-硫酸液 配制方法 饱和苦味酸水溶液100ml,硫酸2ml 固定时间 2~4h 适用组织 胚胎组织 5).carnoy液 配制方法 冰乙酸10ml,氯仿30ml,无水乙醇60ml 固定时间 20~40min,较大组织块不超过2~4h 适用组织 糖原,染色体和尼氏体 6).helly氏液 配制方法 重铬酸钠2.5g,升汞5g,蒸馏水100ml,使用时去上液95ml加入40% 甲醛5ml 固定时间 12~24h 适用组织 骨髓,脾,肝等 7). altmann氏液 配制方法 5%重铬酸钠10ml,2%锇酸水溶液10ml用时配 固定时间 24h 适用组织 脂肪组织,线粒体,神经细胞 8).verhoeff氏液 配置方法 40%甲醛10ml,95%乙醇48ml,蒸馏水36ml,苦味酸 1g 固定时间 48h 适用组织 眼球 9).zenker氏液 配制方法 重铬酸钠2.5g,升汞5g,冰醋酸5ml,蒸馏水100ml 固定时间 24h 适用组织 实验室常备固定液,适用于多种组织的固定 二、石蜡切片 石蜡切片不仅是常规病理中的重要切片形式，也是免疫组化研究中较常用的切片形式，它能满足免疫组化的连续切片要求。为了便于染色及观察，切片时应注意：①连续切片时应按顺序分离及贴片，不应颠倒；②贴片时应距载玻片一端至少1cm，一般靠一边，以利于显色安全；③用于免疫组织化学染色的蜡温应为56—58℃，切片水温在40℃左右，应先置于冷水中，然后再移人热水中，这样可以使切片能顺利展平；④切片刀要求快，切片要薄，无刀痕和皱褶，在染色时可减少非特异染色；⑤烤片时要注意，抗原性较强的组织可在60℃烤3—8h，抗原较弱的组织可于37℃恒温箱内过夜；⑥切片如需长期保存，可置于4℃或室温下，千万不可脱蜡后4℃保存，因脱蜡后失去了对抗原决定簇的保护。 1．铬矾明胶液 试剂：铬矾 0.5g 明胶（Gelatine） 5g H2O ~1000ml 方法：在1000ml的烧杯或烧瓶中，以500～800ml H2O加温溶解明胶，待其完全溶解后，再加入铬矾。注意温度过高易使明胶烧糊，包被玻片时最好控制水温在70℃。如有明显残渣，过滤后使用。 2．甲醛-明胶液 试剂：40%甲醛 2.5ml 明胶 0.5g 蒸馏水 至100ml 配制方法：用少许蒸馏水（约80ml）加热溶解明胶，待完全溶化后，加入甲醛，最后补充蒸馏水至100ml混匀即可。 3．多聚赖氨酸（Poly-L-Lycine,PLL） 试剂：多聚赖氧酸 5g 蒸馏水 ~1000ml 配制方法：称取PLL，溶于H2O，充分混合即可，此液浓度为0.5%，可适当稀释配成0.01～0.5%浓度。4℃保存，也可-20℃备用。PLL可反复冰冻，效果无明显影响，工作液常再稀释10～50倍。 4．Vectabond试剂 该试剂是Vector公司新进推出的一种新型玻片粘附剂。该试剂与一般的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地贴于玻璃片上，贴上后不易脱落，保留时间较久。一个试剂盒（7ml |
11楼2012-05-23 21:18:04
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