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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Hind111 与 Not1双酶切请教 急急急！！！
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madengyu

禁虫 (小有名气)
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1楼 2012-05-17 17:06:50
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子墨青竹

铜虫 (初入文坛)
我最近也做双酶切，用的是TAKARA 的Not1和Sal1酶，同样一起切也没切开，也是单酶切效果，后面用俩个酶各自的酶切buffer切，Not1没切开，Sal1切开了。
Not1体系，我加了30倍过量酶切，跑胶结果和质粒图谱一样，Not1buffer:H*BSA*Triton X-100，完全Takara的按照说明来...切了好几次，从一小时到八小时，都一样切不开
我现在怀疑：1、我提的质粒不够纯，我按照生工小量质粒提取试剂盒提的，
                  2、酶活性被抑制，或者失效了
目前没得到解决，我也好烦这个，实验推不动...
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13楼2014-07-30 17:37:40
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-18 15:20:43
你的质粒是多大的，酶切后应该是多大的片段？
还有就是用HindIII和NotI双酶切是0.5K+BSA，应该是1ul的K Buffer和2ul的BSA。
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未来不是梦
2楼2012-05-17 17:56:11
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madengyu

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
3楼2012-05-17 19:51:03
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-18 15:20:53
我建议你分别用HindIII和NotI做单酶切看看，是哪一个酶的酶切有问题，可能是酶失活，或者酶切条件不合适导致某一个酶的酶切失败。当然，最简单的办法是直接送质粒进行序列分析，就知道是否由序列突变导致酶切位点消失。
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4楼2012-05-17 22:00:51
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