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yanglin0

新虫 (初入文坛)

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专业: 病毒学

[求助] 求教用wWF抗体鉴定内皮细胞的方法

最近我从大鼠心脏和脑中分离到内皮细胞，具体是采用贴块法，即将剪碎的组织块黏附于细胞瓶上，利用内皮细胞迁移的特性分离出内皮细胞。

在完成这一工作后，我需要鉴定分离出的是否是内皮细胞。很多文献采用vWF抗体和免疫组织化学或免疫荧光的方法来鉴定内皮细胞。我订购了vWF抗体，同时采用了这两种方法鉴定大鼠的心脏和脑血管内皮细胞，具体方法如下：

ABC法检测内皮细胞vWF的表达
实验前24小时将原代内皮细胞1：3传代后接种于胶原或明胶包被的24孔板。
(1) 去除细胞培养基，用PBS洗涤1次；
(2) 用-10℃甲醇4℃固定5min，用PBS洗涤3次；
（我也试图用丙酮固定细胞，但因为它能腐蚀细胞培养板而放弃）
(3) 加入用PBS稀释的0.5%的H2O2，室温处理10min，用PBS洗涤2次共5min；
(4) 用含1.5%山羊血清的PBS 室温封闭20min，去除血清；
(5) 用含1.5%山羊血清的PBS 1：1000稀释兔抗人vWF抗体（Abcam ab6994），同时设置仅加1.5%山羊血清的对照，；
(6) 用含1.5% 山羊血清的PBS配制0.5%的生物素标记的羊抗兔抗体（Vector Laboratories PK-4001），室温孵育30min，用PBS洗涤2次共5min；
(7) 用PBS配制含1% A和B的ABC试剂（Vector Laboratories PK-4001），室温孵育30min，用PBS洗涤2次共5min；
(8) 用1mL双蒸水配制含1滴A液、B液和C液的过氧化酶底物（博士德AR1022），室温孵育10~30min，用双蒸水洗涤2次共5min；
(9) 光学显微镜下观察记录。

间接免疫荧光法检测内皮细胞vWF的表达
实验前24小时将原代内皮细胞1：3传代后接种于胶原或明胶包被的24孔板。
(1) 去除细胞培养基，用PBS洗涤一次；
(2) 4%多聚甲醛室温下固定30min，用PBS洗涤3×5min；
（同事建议用0.2%的Triton透化，不知是否有帮助）
(3) 用含5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS 37℃封闭1h；
(4) 用含1% BSA的PBS 1：400稀释兔抗人vWF抗体（Abcam ab6994），同时设置仅加1% BSA的对照，37℃孵育2h或4℃孵育过夜，用含0.05% Tween20的PBS洗涤3×5min；
(5) 用含1% BSA的PBS 1：100稀释FITC标记的羊抗兔抗体（Zymed laboratories），37℃避光孵育1h，用含0.05% Tween20的PBS洗涤3×5min；
(6)用1：2000稀释的Hoechst33258室温复染细胞5min，用含0.05% Tween20的PBS洗涤3×5min；
(7)荧光显微镜下观察记录。

结果两种方法均未检测到阳性信号。由于想验证是否是方法的问题，我购买了小鼠胰岛内皮细胞系MS1作为阳性对照，因为它是国内仅有的可以购买到的内皮细胞系并据ATCC介绍表达vWF。然而我采用上述的方法均未检测到阳性信号，同时我采用了国产的wWF抗体重复这些实验也没有检测到阳性信号。

由于我对内皮细胞鉴定的方法并不熟悉，因此请有相关经历的同行看一下我采用的实验程序，是否有可能的问题，同时对进一步的实验提出建议。

谢谢！

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