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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 包涵体溶解
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jamy1989

木虫 (小有名气)

[求助] 包涵体溶解

我的目的蛋白是以包涵体存在的，溶解了半个月了，还是没溶解出来，跑胶后总显示在沉淀里！我该怎么办？
我的溶解方法是：
1、先用PBS和EDTA 洗三次菌体
2、用PBS重新悬浮，加入EDTA和PMSF超声 打3秒停5秒 20min超声的中途还加了EDTA和PMSF
3、4° 10000rpm 10min分开收集上清和沉淀（上清跑后没有目的蛋白）
4、沉淀用PBS和2M 尿素 EDTA 和巯基乙醇、Nacl洗了两次
5、用20ml 8M尿素、EDTA TrisHcl Nacl PMSF 和巯基乙醇溶解了一个半小时！PH在10左右
6、加5ml 磷酸二氢钾和0.5M EDTA 0.02ml 1M Nacl0.5ml 另加水至100ml制成缓冲液II 取10ml加到样品中，室温放置半个小时！
7、12000rpm 4° 15min离心，去上清和沉淀跑胶！结果上清什么都没有，沉淀跑出了目的蛋白！
请问谁可以帮帮我呀！？？急呀！！！
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qwdr
1楼 2012-04-06 22:18:39
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

jiangyhai

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaohq1209: 金币+2, 有帮助，鼓励鼓励 2012-04-08 13:39:27
jamy1989: 金币+5, ★有帮助 2012-04-12 10:47:02
用7M盐酸胍试试。
有些包涵体尿素不能溶解。
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静心做事。
5楼2012-04-08 12:41:21
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普通回帖

biowandy

木虫 (正式写手)
★ ★
zhaohq1209: 金币+2, 有帮助，鼓励应助~ 2012-04-08 13:39:13
你加了多少巯基乙醇？不行就加到10mM以上，另外 你在用8M尿素溶解的时候最好超声5-10min，如果这样不行，那应该有点玄乎
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2楼2012-04-07 09:31:04
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jamy1989

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biowandy at 2012-04-07 09:31:04:
你加了多少巯基乙醇？不行就加到10mM以上，另外 你在用8M尿素溶解的时候最好超声5-10min，如果这样不行，那应该有点玄乎

加了1mM的，我试试你的方法啊！谢谢！
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qwdr
3楼2012-04-07 11:32:12
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jamy1989

木虫 (小有名气)
各位好友给点建议呀！！！！
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qwdr
4楼2012-04-08 11:33:48
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jamy1989

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jiangyhai at 2012-04-08 12:41:21:
用7M盐酸胍试试。
有些包涵体尿素不能溶解。

盐酸胍在酸性条件下容易引起沉淀并且复性后可能造成大量蛋白质沉淀和蛋白质离子交换有挺大影响的！！
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qwdr
6楼2012-04-08 12:58:35
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jiangyhai

金虫 (著名写手)
zhaohq1209: 编辑内容 2012-04-08 13:40
zhaohq1209: , 为了虫友的安全和利益，请不要留qq等其他联系方式 2012-04-08 13:41:04
zhaohq1209: , 已经删除了您留下的qq号码 2012-04-08 13:41:19
引用回帖:
6楼: Originally posted by jamy1989 at 2012-04-08 12:58:35:
盐酸胍在酸性条件下容易引起沉淀并且复性后可能造成大量蛋白质沉淀和蛋白质离子交换有挺大影响的！！

我们公司提供包涵体复性技术服务，要不您送到我们公司试试。

[ Last edited by zhaohq1209 on 2012-4-8 at 13:40 ]
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静心做事。
7楼2012-04-08 13:06:04
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cuipibird

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jiangyhai at 2012-04-08 13:06:04:
我们公司提供包涵体复性技术服务，要不您送到我们公司试试。

经过盐酸胍变性处理的蛋白是需要一些时间复性的，可以透析复性
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8楼2012-04-08 20:44:39
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jamy1989

木虫 (小有名气)
多谢各位好友，我溶解出来了！
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qwdr
9楼2012-04-12 09:25:20
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cuipibird

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cuipibird at 2012-04-08 20:44:39:
经过盐酸胍变性处理的蛋白是需要一些时间复性的，可以透析复性

你好！问一下你是怎样诱导细菌表达包涵体的，将细菌的吸光度控制在多大范围比较容易产生包涵体？厌氧与有氧怎样控制？
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10楼2012-04-23 19:52:33
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