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土壤中碱性磷酸酶的测定方法 已有1人参与
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| 有谁知道怎么测定土壤中的碱性磷酸酶，我要详细步骤 |
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 生物工程 |
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【答案】应助回帖
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脲酶 《土壤酶及其研究法》 P ．296． 1．试剂配制 (I)ph=6．7柠檬酸盐缓冲液：取368g柠檬酸溶于600ml蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将二种溶液合并，用1N氢氧化钠将ph调至6．7，并用水稀释至2L。 (2)苯酚钠溶液：称62．5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mI甲醇和18．5ml丙酮，然后用乙醇稀释至100ml(A液)，保存在冰箱中。称27g氢氧化钠溶于100ml水中(B掖)，保存在冰箱中。使用前取A．B两液各20ml混合，并用蒸馏水稀释至100ml备用。 (3)次氯酸钠溶液：用水稀释制剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 (4)l10％尿素液。 (5)甲苯。 (6)氮的标准溶液：精确称取0．4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，则得1ml含0．1mg氮的标准液。绘制标准曲线时，可再将此液稀释10倍供用。 标准曲线绘制：吸取稀释的标准液1、3、5、7、9、11、13mI，移于50ml容量瓶中，然后加蒸馏水至20mI。再加4ml苯酚钠镕液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲线。 2.操作步骤 取5g风干土，置于50mI三角瓶，加1ml甲苯。15min后加10ml 10％尿素液和20ml ph6．7柠檬酸盐缓冲液。摇匀后在37度恒温镕中培养24h。过滤后取3ml滤液注入50ml容量瓶，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。 3．计算 脲酶活性以24h后1g土壤中NH3—N的毫克数表 示。 NH3—N(mg)＝a X 2 式中 a——从标准曲线查得的NH3一N毫克数 2——换算成1g土的系数 转化酶 《土壤酶及其研究法》•276．比色法 1．试剂配制 (1)3，5—二硝基水杨酸溶液；称0．5g二硝基水杨酸，溶于20ml2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml(不超过7天)。 (2)PH5．5磷酸缓冲液：1／15M磷酸氢二钠（11．867g 溶于1L蒸馏水中)0.5ml加1／15M磷酸二氢钾(9．078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中)9.5ml即成。 (3)8％蔗糖溶液。 (4)甲苯。 (5)标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58度条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg溶于100ml苯甲酸溶液中(5mg还原糖／ml)，即成标准葡萄糖溶液。再用标准液制成1ml含 0.01—0.5mg葡萄糖的工作溶液。 标准曲线绘制：取1ml不同浓度的工作液，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显包，比色后以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。 2．操作步骤 称5g风干土，置于50ml三角瓶中，注入15ml 8％蔗镕溶液，5ml pH5．5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3ml 3，5--二硝基水杨酸,并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水扬酸而呈橙色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色 为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。 3．结果计算 蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表 示。 葡萄糖(毫克)=a x 4 式中 a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数 4——换算成1g土的系数 磷酸酶《土壤酶及其研究法》磷酸苯二钠比色法P310 1．试剂配制 (1)0.5％磷酸苯二钠(用缓冲液配制)． （2)pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、 pH9．4硼酸盐缓冲液。 (3)氯代二溴对苯醌亚胺试剂；取0．125g 2．6—二溴苯醌氯酰亚胺。用10ml 96%乙醇溶解，贮存于棕色瓶中，放在冰箱里。保存的黄色溶液末变褐色之前均可使用。 (4)酚的标准溶液： 酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释1L，贮于棕色瓶中。 酚工作液--取10ml酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。 (5)甲苯。 (6)0．3％硫酸铝溶液。 标淮曲线绘制：取1，3，5，7，9，11和13ml酚工作液，置于50m[容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试刘，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以光密度为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。 2．操作步骤 称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2．5mI甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5％磷酸苯二钠(酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液，碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液)，仔细摇匀后放入恒温箱，在37度下培养24h。后于培养液中加100ml 0.3％硫酸铝溶液并过滤。 吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。 3．结果计算 磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。 酚(mg)=a×8式中 a——从标准曲线上查得的酚毫克数 8——换算成1g土的系数 |
2楼2014-04-22 18:31:41