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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 王晓东的科研思路追踪
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seasonbird2002

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1楼 2007-03-25 11:54:10
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思考者

木虫 (正式写手)
三板斧——王晓东科研思路简评


其实研究王晓东的科研思路，发现这个规律是相当明显的，他自己也曾在讲课时提到科研的三板斧，其中的两板斧肯定是：建立体外生化检测系统，用这个系统跟踪蛋白纯化过程。他的过人之处就在于他的实验室能用 100升的细胞，过5，6个column最终纯化得到单一的生化组分。这个毅力有点像那个从几十万个猪脑提取某个激素的故事，他的实验比提激素可能要简单，但是他提取的不是一个，而可能是几个，这几个将细胞调亡线粒体途径阐述得相当干净明了（干净的意思是他用体内尤其是体外重建实验证明的，不像某些文章结论模糊不清）。

建立体外检测系统，跟踪纯化蛋白这个思路如果有办法实现基本上是万能的，王用同样的方法研究RNAi发现了RNAi pathway里一个很重要的蛋白就是一个例证。

有兴趣的同学可以读读他的文章
http://www.swmed.edu/home_pages/ ... ic/publications.htm
他的实验室主页
http://www.swmed.edu/home_pages/wanglab

王晓东说世界上没有他纯化不出来的蛋白，呵呵。其实，他的lab纯化是很厉害，但决不至于天下唯一。他们最初做出cytochrome c还是有些lucky的，

思路倒是比较直接，看上去比较简单，建立好体外检测系统，然后开始分离不同组分，结合DNA ladder（他们用这个做凋亡检测体系），直到最后分离到单一有效组分为止。但事实远不是这么简单，因为凋亡过程现在大家都知道，是多个蛋白参与，这就大大增加了分离难度。同时重组4，5个组分不太可能，技术上现在几乎达不到（事实上，他们后来鉴定了3个组分，加一个人工组分，这已经是很牛了，做过纯化的人就知道，光一个就要玩死好多人）这里最关键的是体外凋亡系统的建立，分离是复杂烦琐的，所以体外检测系统一定要简单，有良好的重复性，不然，大家可以想象这个纯化太难做了，或者说几乎不可能，因为你所有的纯化都是以这个检测系统为指导的。

起初，他们想要建立这样一个检测系统，然后就搞一个细胞抽提物，当然它自身不会诱导凋亡，然后他们就尝试加东西，加任何可以加的东西，只要能诱导凋亡就行。事实上王提起往事，说，一直到他们快要绝望的时候，他们幸运地发现一个本来用来当作dATP的对照，ddATP的东东可以强烈地诱导凋亡(当然，大家现在也应该意识到，他纯化的细胞组分里，mitochondria是有一点破裂的，不然cytochrome c不会释放出来，凋亡也不可能发生，这又是一个lucky的东东，呵呵)，所以，后来他们把dATP提高到能诱导凋亡的浓度，这样，才有可能做后面的分离纯化。事实上，分离出apoptosome里的几个组分到不需要绝顶高手，（后面的工作才真正可以体现他lab的超强纯化能力）。从王lab出去的li peng现在singapore，后来hongkong做出了另外两个mitochondria里释放出的蛋白也能诱导凋亡，其实我看到很多做纯化很牛的实验室，在别的领域，要加入进来也是做东西的，但这个领域通过这种方法再也做不出令人exciting的data了，包括王现在在做的，都是添砖加瓦的工作。扯远了，呵呵。

后来大家都知道，那个apoptosome model，其中的dATP很重要，但实际上他的体外系统用的dATP的浓度是体内的1k倍（更高？不记得了，有兴趣的可以自己去查.所以，体内真实情况是和他这个model不完全一样的。

王觉得在生理dATP浓度下，一定有其它的因子参与了apoptosome的组装.在一篇正在reviewing 的paper里，他通过借助chemical genetics方法筛选出的一个抑制凋亡的小分子，在基于UV诱导的凋亡检测体系下（这样就去处了高浓度dATP的作用），纯化到另外两个分子能够帮助组装apotosome。到时候大家看那篇paper，那才是纯化真功夫的显示。

我其实觉得王晓东过人之处并不在于他的纯化，前面说过，其实在其它领域也有很多用体外系统来研究机制的牛lab，但王是第一个把这个系统引入apoptosis的人。所以，掘了第一桶金。以前介绍过许田也是如此，第一个把tumor的概念引入drosophila，做出了漂亮的工作。这个第一个才是重要的，王没有谈当时是否有忐忑的感受，但许是说了，他当时和别人说这个idea之前，没有人理会他，倒是有不少嘲笑：）。我想，王在没找到ddATP之前，也是极其郁闷的吧，这个时候，对自己的idea没有坚强的信念，是走不下去的。当然，他也有一点点lucky：）

实际上，总有人固执地认为保守的是非常重要的，当然新的演化也是必须的和重要的。我也觉得保守的通路不可被忽视。

关于凋亡的通路，就mammalian cell而言，现在主要集中在Death Receptor 和mitochondr a pathway上，但这并不意味着这两条就是全部。

death receptor很重要，因为之不光介导stress－induced apoptosis，同时也介导免疫细胞的apoptosis，体内实验也证实了这一点。而对mitochondria pathway事实上大部分数据是建立在stress－induced apoptosis上，这个全世界都广为采用的系统极有可能夸大了cytochrome c的作用。因为实际上大家用的都是tumor cell line，而tumor的一大特征就是获得avoid apoptosis的特性，所以，有可能mitochondria－independent apoptosis pathway 发生了loss/gain of function，而mitochondria pathway里的proteins stored in mitochondria很少报道突变，比如cytochrome c，smac，Endo G。

通常这条pathway在tumor cell line里的变化只发生在其它调控蛋白上，比如BCL－2，XIAP过表达之类。所以，一种解释可以说那些mitochondria蛋白有其它的生物学功能，对cellsurvival必须，所以，这样一来，就有可能使得在dish里培养的tumor cell line基本上都依靠这条通路才能走向apoptosis。

所以，那篇genes&dev做出来的oncogene－induced apoptosis很重要，提示可能不光是stress，cytochrome c在其它的凋亡诱导途径中也起重要作用。早期作出来的是p53通过转录下游effector作用在mitochondria上，这篇文章是c－myc。也许还有其它更多的，但可惜现在还没有多少报道。

stress这种诱导方式太复杂，说不清楚,最终的结论还是要在体内得到才能下。有一点要说明的是，caspase和mitochondria pathway是不能等同的。

相关蛋白的KO mice的建立也部分说明了mitochondria这条通路在发育中起重要作用。但这些数据本身解释起来就很复杂，远远没有得出统一的结论，似乎这条pathway中的各个effector都负责不同的组织的凋亡。

现在的热点，就象你说的，去研究cytochrome c和其它一大堆鬼东西怎么释放出来，真是无聊极了，呵呵（个人喜好）。

我自己感觉在体内mitochondria pathway不是细胞首选自杀方式，改变现在的研究系统，抛弃tumor cell line：）也许可以得出更多的有意思的东东。所以，线虫和果蝇才显得那么重要，不然，有谁认为在果蝇里研究凋亡还有什么用？因为它们是in vivo，而不是仅仅因为它们也保守。
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It is not enough to discover something new; one has to demonstrate its significance, a much more difficult task.
6楼2007-03-26 17:03:55
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独孤久健
谢谢分享！
2楼2007-03-25 12:54:03
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思考者

木虫 (正式写手)
不错！
直接贴出来，排排版就跟好了！
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It is not enough to discover something new; one has to demonstrate its significance, a much more difficult task.
4楼2007-03-26 16:55:14
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思考者

木虫 (正式写手)
王晓东成名的核心成果是细胞色素C的发现。其他的成果可以看成是在这个发现的基础上的上下游的扩展。
对于这个细胞色素C的发现，基本方法是王晓东拿细胞抽提掖过多个层析柱分离蛋白，检测活性峰，最后得到比较纯的活性蛋白，发现是细胞色素C。

这种screen蛋白的思路，是70-80年代没有基因screen技术的时候非常流行的技术，很多重要蛋白都是这样发现的。

对于这些screen的实验，更依赖于运气而不是idea，因为你不知道你能得到什么，只能拿最后得到的东西去分析结果。试想如果apoptosis中本来就没有细胞色素C的参与，王晓东现在可能还是一个普通faculty。或者王晓东晚两年动手，就可能有别人做出来。

个人认为这里有点把王晓东神话了。具体说来王晓东的idea，并不一定比其他的人高出一等。

现在是分子生物学的时代，似乎大家都对那些耗时费力的纯化实验不屑一顾。王晓东自己也说过，做好的science要比较“傻”的人才行。说到底还是一个研究方法的问题，我们只能从实验得到的现象来学习下一步实验该往那里走，而不是用现在已知的模型去fit你的数据，如果天天想着耍小聪明，找捷径，最后可能一事无成。王晓东的成功可能有很多运气的成分，但是这种研究方法却是现在大多数人都缺乏的。一个好的实验方法是很难用落伍不落伍来形容的，有很多用了几十年的实验方法，在今天看来仍然是经典。

能把经典的手段运用到极致，在这个领域能做到这一点的少得很；为什么是王晓东挖到这座金矿而不是其他人。我不觉得这里有神话王晓东的意思，他就是调亡领域里首屈一指的大牛。

相对于研究方法来说，选定研究方向更为重要。王小东的成功很大程度上是因为他选了凋亡机制这个重要的方向，再加上机遇和运气他后面要做的RNAi机制的研究方向无疑也是很重要的。Stanley J. Korsmeyer， 和王教授是研究类似问题的，用不同的多样的方法，对该领域的贡献尚在王教授之上。他发论文的速度是王教授无法相比的，不想说他更优秀，但不可否认，研究手段的差别是一个重要因素。

基于活性介导的活性成分分离? assay-based active componnent purification

这个思路是很经典的思路，同时另外一个意思就是很老套的思路。

前面有人说得很对，最重要的是在合适的时间选对了合适的方向，至于具体的技术、思路，很多都是常规的。

比如Watson和Crick发现DNA double helix结构，就是在合适的时间选择了合适的方向的经典的例子。当时蛋白的二级结构已经发现，结晶学技术也有突破，亟待解决DNA的二级结构的问题，当时Pauling等大牛都在做，可以说，如果Watson 和Crick没发表他们的结构的话，这个问题基本上也大致能在六十年代得到解决。当然，不能排除天才科学家的贡献，但是具体谁做出成果，有时也有一定的运气成分。

我的理解是，各方面的研究基础、工具基本具备，该领域文献数最少，有足够眼光认识其长远的价值，这个时候就看谁开始捞第一桶金了。

生物实验更多的是扎扎实实的体力活，是bench work。要贯彻一个好的课题，很多时间都是花在如何解决实验细节上的。如果做学生的一开始就想要做哲学高度的idea，往往会竹篮打水一场空。

做任何事情，如果能把一件事情做深，研究透，不说功成名就，混口饭吃就比较容易了。
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It is not enough to discover something new; one has to demonstrate its significance, a much more difficult task.
5楼2007-03-26 16:55:58
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