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2010203011银虫 (小有名气)
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[求助]
救命啊！荧光定量PCR 扩增问题
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质粒扩增和样品扩增曲线不一样。 1，湖水总细菌DNA提取，Omega biotek的水体DNA提取试剂盒 2，引物为文献中的经典引物，退火温度在梯度PCR仪上找的较为适合的温度。 3，荧光定量PCR仪为ROTOR Gene-6000，试剂盒为QIAGEN。 4，质粒是用样品DNA的PCR产物，回收后重组后提取，按10倍稀释成标准品。 结果，每次做的试验结果，样品的扩增曲线总是很奇怪，不光滑。和质粒就很不一样。我已经排除了以下几个原因： 1. 扩增体系，QIAGEN 和Takara的试剂盒都试过，一样的 问题 2.仪器问题，用过ABI7500比较过，一样的 问题。 3. 引物，都是文献中比较常用的引物，noszF/1622-R等。 4.模板，借用了别人用mobio提取的土壤DNA，也有问题，是不是可以排除不是试剂盒的问题？ 5.耗材，ABI和Axygen的用，也没有解决问题。 求救，博士二年级了，文章还在等数据，急死人了，不知道有没有碰到这样情况的，请教啊~   |
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jianandy
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| 我觉得应该是环境样品DNA的问题，里面可能有一些影响PCR扩增的东西，是不是应该纯化一下？ |
201020301111楼2012-03-18 14:51:58
3楼2012-03-14 00:22:27
【答案】应助回帖
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| 换一种菌的DNA为模板试一下，有可能是从土壤中提取基因组含有杂质影响qPCR的体系吧。排除样本质量的影响 |
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4楼2012-03-14 09:10:49
yz_fish
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把湖水提取出来的模板DNA稀释十倍，一百倍或者一千倍后试试，保证楼主能得到心仪的扩增曲线 |
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5楼2012-03-14 10:03:03
