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qlj0125

铜虫 (初入文坛)

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帖子: 43
在线: 23小时
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[交流] qPCR阴性对照有扩增

我是做miRNA检测的，之前一直没扩出来，现在有扩增而且曲线非常漂亮，关键就是阴性对照也有扩增。我用不同的cDNA浓度进行稀释，发现CT值是随着cDNA浓度降低而升高的，那应该就是引物污染的可能性很大。
但是如果全部换引物的话成本问题蛮大，因为不仅仅是miRNA的引物，还包括内参以及第二链的引物都要换。我做的是相对定量，所以我是想知道，在保证扩增的产物是由cDNA模板而来的情况下，阴性对照有扩增影响计算吗？或者说这样的结果可不可以用？
急急急！

[ Last edited by qlj0125 on 2012-3-13 at 16:06 ]

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1楼 2012-03-13 16:04:53

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领航123456

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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帖子: 6
在线: 32分钟
虫号: 3766476

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

你的阴性对照是指的反转录时的非模板对照吧，如果这个对照出现扩增起峰，Ct值和实验组相差<5的话，你的数据是不可靠的，这样的数据属于假阳性扩增，是由于miRNA定量引物引起的，因为反向引物用的是通用引物，只有正向是特异的，扩增产物的特异性是没有保证的，这也是国内miRNA定量试剂盒的缺陷所在，建议你用下双向也就是上下游都是特异性引物的试剂盒，可以解决假阳性扩增的问题。