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qlj0125

铜虫 (初入文坛)


[交流] qPCR阴性对照有扩增

我是做miRNA检测的,之前一直没扩出来,现在有扩增而且曲线非常漂亮,关键就是阴性对照也有扩增。我用不同的cDNA浓度进行稀释,发现CT值是随着cDNA浓度降低而升高的,那应该就是引物污染的可能性很大。
    但是如果全部换引物的话成本问题蛮大,因为不仅仅是miRNA的引物,还包括内参以及第二链的引物都要换。我做的是相对定量,所以我是想知道,在保证扩增的产物是由cDNA模板而来的情况下,阴性对照有扩增影响计算吗?或者说这样的结果可不可以用?
    急 急 急!

[ Last edited by qlj0125 on 2012-3-13 at 16:06 ]
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领航123456

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你的阴性对照是指的反转录时的非模板对照吧,如果这个对照出现扩增起峰,Ct值和实验组相差<5的话,你的数据是不可靠的,这样的数据属于假阳性扩增,是由于miRNA定量引物引起的,因为反向引物用的是通用引物,只有正向是特异的,扩增产物的特异性是没有保证的,这也是国内miRNA定量试剂盒的缺陷所在,建议你用下双向也就是上下游都是特异性引物的试剂盒,可以解决假阳性扩增的问题。
3楼2015-05-07 09:07:29
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rb

木虫 (著名写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
阴性扩增了,那么结果就不可靠了。建议还是换了吧,一个小包装的荧光探针加引物不到600,很便宜的。不用那么计较了。
2楼2012-06-08 14:56:44
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