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judy520

金虫 (小有名气)

[求助] 质粒转化完 传代后发现变小 再传一代质粒直接消失了

从老外那要来一个质粒11.3kb,转化大肠杆菌DH5a很正常,提质粒后条带如下

之后转化ET12567 转化很困难但是终于转进去了,提质粒如下:
第五道和第六道的是转进去的 很高兴 结果后面准备做接合转移 把保的菌摇起来提质粒发现质粒变小了  第二天再摇再提 质粒直接不见了

一道Marker, 二、三道ET12567原菌提质粒,四五道 质粒变小  六七道 质粒不见了 请问又没人遇到过相似的问题呀  有人说是需要recA缺失的ET12567菌 我不晓得我们实验室的是不是 前人留下的  这个能验证吗?
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敢于开始
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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judy520: 金币+3, ★★★很有帮助, 很好的思路 2012-03-22 16:58:28
可以把PUZ8002转化进DH5a,进行接合转移,效率低点,但是对于一些模式菌足够了.
13楼2012-03-20 19:04:54
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
judy520(金币+3): 有帮助 2012-03-07 17:35:26
不知道你的质粒是不是具有抗生素抗性,在传代培养时是否在培养基中加入了相应的抗生素。再有,质粒形成超螺旋结构后,在琼脂糖电泳中的迁移速度会加快,希望这些对你有些帮助。
2楼2012-03-07 15:51:32
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liudt1105

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
judy520(金币+1): 有帮助 2012-03-07 17:35:40
你的培养基配方是什么啊?
这些大肠杆菌工程菌往往有缺陷,要注意控制生长速度,长得太快了质粒就掉了。放慢点速度试试看?
安琪酵母浸粉、蛋白胨,您实验的好助手
3楼2012-03-07 15:51:38
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
judy520(金币+1): 有帮助 2012-03-07 17:36:13
确定是否有筛选压力,如果没有,传代过程中质粒很容易丢失。
Thank-you,so-blue.
4楼2012-03-07 16:27:15
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