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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 质粒转化完 传代后发现变小 再传一代质粒直接消失了
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judy520

金虫 (小有名气)

[求助] 质粒转化完 传代后发现变小 再传一代质粒直接消失了

从老外那要来一个质粒11.3kb，转化大肠杆菌DH5a很正常，提质粒后条带如下

之后转化ET12567 转化很困难但是终于转进去了，提质粒如下：
第五道和第六道的是转进去的 很高兴 结果后面准备做接合转移 把保的菌摇起来提质粒发现质粒变小了  第二天再摇再提 质粒直接不见了

一道Marker， 二、三道ET12567原菌提质粒，四五道 质粒变小  六七道 质粒不见了 请问又没人遇到过相似的问题呀  有人说是需要recA缺失的ET12567菌 我不晓得我们实验室的是不是 前人留下的  这个能验证吗？
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敢于开始
1楼 2012-03-07 15:35:35
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

whb21

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by whb21 at 2012-03-08 09:33:28:
建议你查一下这个质粒的详细资料，质粒大小应该不会在1000-2000左右，再有提取方法是不是存在使得质粒断裂的问题或者提出来的根本就不是质粒。

很有可能是转座子作用下发生了重组，导致质粒一部分插入到染色体中了，这样比较麻烦，接下来表达蛋白基本是不行了....
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10楼2012-03-09 10:44:55
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普通回帖

whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
judy520(金币+3): ★有帮助 2012-03-07 17:35:26
不知道你的质粒是不是具有抗生素抗性，在传代培养时是否在培养基中加入了相应的抗生素。再有，质粒形成超螺旋结构后，在琼脂糖电泳中的迁移速度会加快，希望这些对你有些帮助。
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2楼2012-03-07 15:51:32
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liudt1105

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
judy520(金币+1): ★有帮助 2012-03-07 17:35:40
你的培养基配方是什么啊？
这些大肠杆菌工程菌往往有缺陷，要注意控制生长速度，长得太快了质粒就掉了。放慢点速度试试看？
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安琪酵母浸粉、蛋白胨，您实验的好助手
3楼2012-03-07 15:51:38
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
judy520(金币+1): ★有帮助 2012-03-07 17:36:13
确定是否有筛选压力，如果没有，传代过程中质粒很容易丢失。
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Thank-you，so-blue.
4楼2012-03-07 16:27:15
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judy520

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by whb21 at 2012-03-07 15:51:32:
不知道你的质粒是不是具有抗生素抗性，在传代培养时是否在培养基中加入了相应的抗生素。再有，质粒形成超螺旋结构后，在琼脂糖电泳中的迁移速度会加快，希望这些对你有些帮助。

谢谢回复 有安普霉素抗性 一直有加抗生素的  我质粒变小的很夸张  条带在1000和2000之间  在DH5a里提出来条带在8000左右
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敢于开始
5楼2012-03-07 16:39:30
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judy520

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by liudt1105 at 2012-03-07 15:51:38:
你的培养基配方是什么啊？
这些大肠杆菌工程菌往往有缺陷，要注意控制生长速度，长得太快了质粒就掉了。放慢点速度试试看？

我一直用的LB培养基  摇一夜 很奇怪质粒为什么会变小呢 是ET12567里有核酸酶 把质粒切掉一部分吗
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敢于开始
6楼2012-03-07 16:41:14
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whb21

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by susizheng at 2012-03-07 16:27:15:
确定是否有筛选压力，如果没有，传代过程中质粒很容易丢失。

建议你查一下这个质粒的详细资料，质粒大小应该不会在1000-2000左右，再有提取方法是不是存在使得质粒断裂的问题或者提出来的根本就不是质粒。
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7楼2012-03-08 09:33:28
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judy520

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by whb21 at 2012-03-08 09:33:28:
建议你查一下这个质粒的详细资料，质粒大小应该不会在1000-2000左右，再有提取方法是不是存在使得质粒断裂的问题或者提出来的根本就不是质粒。

质粒图谱我这里有  质粒上有转座子 怀疑转座子是不是发生转座 提取手法没有问题  同株菌里有个60多kb的质粒给提出来了   目前在做PCR、酶切看变小的那个东西是不是质粒的一部分  老板不让测序 只能用别的手段了
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敢于开始
8楼2012-03-08 13:25:55
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zhen_fang

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
长得快就容易丢失，选择保险的方法传代吧
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9楼2012-03-09 09:32:59
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