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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒构建
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)

[交流] 质粒构建

近期我构建质粒，用DH5α转化，转化后抗性平板上有菌落，但是挑单克隆后提不出质粒。已近验证感受态没有问题
1、若果说没有转化进质粒，可为什么在抗性板上会长了（抗性板没有问题）？
2、若转化进去的是空载体，可为什么提不出质粒？
3、若是连接没有连接上，那么就没有质粒可以转化进去，可为什么抗性板上长有菌落？
求高人解答，先谢谢了。

[ Last edited by wcx蜗牛 on 2012-3-5 at 22:03 ]
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1楼 2012-03-05 21:36:09
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冰凝东

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+2): 鼓励热心应助！ 2012-03-07 12:24:46
wcx蜗牛(金币+2): 2012-03-08 09:34:21
引用回帖:
8楼: Originally posted by wcx蜗牛 at 2012-03-07 09:51:11:
问下，你做菌液pcr是挑单克隆与液体培养基中培养一段时间后，直接用菌液做模板pcr的，还是其他方法。

是的！！挑单克隆于相应抗性的液体培养基中，如果是1.5ml的我一般是震荡培养2-4个小时后以菌液为模板进行PCR检测，PCR体系跟你之前用的完全一样，只是模板加的是新鲜菌液。之后凝胶电泳检测，有目的条带的则进行大摇已提取质粒。可以说连接后载体转化是必须要做菌液PCR的，否则很有可能是原始载体没有切开的假阳性啊……
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9楼2012-03-07 10:18:47
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younger123

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
小丹木木(金币+2): 很有用哦，想的很仔细哦 2012-03-06 10:58:16
1.你的感受态真的没有问题吗？会不会这个感受态已受污染，已经带有抗性了，不如你换一种感受态来试一下，例如JM109之类的。
2.你长出来的菌落是否分布均匀，数量不会只有几颗吧？大小是否均一，如果不是，那么可能是杂菌吧。
3你的抗生素会不会失效了？
4.要不你尝试拿空质粒来转化一下来验证一下你的感受态是否没有问题先。
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2楼2012-03-05 23:30:58
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麻花13

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wcx蜗牛(金币+2): 2012-03-07 09:48:32
建议在做转化的同时，做一下阳性对照和阴性对照，此外，不建议挑取平板边缘的克隆
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3楼2012-03-06 09:47:11
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whb21

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wcx蜗牛(金币+1): 2012-03-07 09:51:17
西瓜(金币+1): 确实，对照很重要！ 2012-03-07 12:23:11
转化过程中出现假阳性是很正常的，建议你再做转化时候分别作阴性和阳性对照。这样以便于分析，祝好运
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4楼2012-03-06 09:55:46
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