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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒构建
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)

[交流] 质粒构建

近期我构建质粒，用DH5α转化，转化后抗性平板上有菌落，但是挑单克隆后提不出质粒。已近验证感受态没有问题
1、若果说没有转化进质粒，可为什么在抗性板上会长了（抗性板没有问题）？
2、若转化进去的是空载体，可为什么提不出质粒？
3、若是连接没有连接上，那么就没有质粒可以转化进去，可为什么抗性板上长有菌落？
求高人解答，先谢谢了。

[ Last edited by wcx蜗牛 on 2012-3-5 at 22:03 ]
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1楼 2012-03-05 21:36:09
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younger123

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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小丹木木(金币+2): 很有用哦，想的很仔细哦 2012-03-06 10:58:16
1.你的感受态真的没有问题吗？会不会这个感受态已受污染，已经带有抗性了，不如你换一种感受态来试一下，例如JM109之类的。
2.你长出来的菌落是否分布均匀，数量不会只有几颗吧？大小是否均一，如果不是，那么可能是杂菌吧。
3你的抗生素会不会失效了？
4.要不你尝试拿空质粒来转化一下来验证一下你的感受态是否没有问题先。
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2楼2012-03-05 23:30:58
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麻花13

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
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wcx蜗牛(金币+2): 2012-03-07 09:48:32
建议在做转化的同时，做一下阳性对照和阴性对照，此外，不建议挑取平板边缘的克隆
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3楼2012-03-06 09:47:11
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whb21

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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wcx蜗牛(金币+1): 2012-03-07 09:51:17
西瓜(金币+1): 确实，对照很重要！ 2012-03-07 12:23:11
转化过程中出现假阳性是很正常的，建议你再做转化时候分别作阴性和阳性对照。这样以便于分析，祝好运
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4楼2012-03-06 09:55:46
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冰凝东

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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wcx蜗牛(金币+1): 2012-03-07 09:51:29
西瓜(金币+1): 鼓励交流。不过菌液PCR假阳性率也不低呢。 2012-03-07 12:24:08
连接后的转化，以菌液为模板进行PCR，检测目的基因是不是真的连接到载体上了，同时也可以鉴定是不是杂菌……然后再考虑其他原因啊……
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5楼2012-03-06 19:17:22
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by younger123 at 2012-03-05 23:30:58:
1.你的感受态真的没有问题吗？会不会这个感受态已受污染，已经带有抗性了，不如你换一种感受态来试一下，例如JM109之类的。
2.你长出来的菌落是否分布均匀，数量不会只有几颗吧？大小是否均一，如果不是，那么可 ...

谢谢，昨晚验证感受态没有什么问题。菌落分布不是很均匀，有的皿长的多，有的少。转化时经常出现假阳性，请问你平时做实验怎么避免的。谢谢
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6楼2012-03-07 09:46:20
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 麻花13 at 2012-03-06 09:47:11:
建议在做转化的同时，做一下阳性对照和阴性对照，此外，不建议挑取平板边缘的克隆

谢谢，不挑去边缘克隆，下次注意下。转化很容易出现假阳性，请问你平时实验时怎么避免假阳性的，谢谢！
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7楼2012-03-07 09:48:14
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 冰凝东 at 2012-03-06 19:17:22:
连接后的转化，以菌液为模板进行PCR，检测目的基因是不是真的连接到载体上了，同时也可以鉴定是不是杂菌……然后再考虑其他原因啊……

问下，你做菌液pcr是挑单克隆与液体培养基中培养一段时间后，直接用菌液做模板pcr的，还是其他方法。
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8楼2012-03-07 09:51:11
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冰凝东

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+2): 鼓励热心应助！ 2012-03-07 12:24:46
wcx蜗牛(金币+2): 2012-03-08 09:34:21
引用回帖:
8楼: Originally posted by wcx蜗牛 at 2012-03-07 09:51:11:
问下，你做菌液pcr是挑单克隆与液体培养基中培养一段时间后，直接用菌液做模板pcr的，还是其他方法。

是的！！挑单克隆于相应抗性的液体培养基中，如果是1.5ml的我一般是震荡培养2-4个小时后以菌液为模板进行PCR检测，PCR体系跟你之前用的完全一样，只是模板加的是新鲜菌液。之后凝胶电泳检测，有目的条带的则进行大摇已提取质粒。可以说连接后载体转化是必须要做菌液PCR的，否则很有可能是原始载体没有切开的假阳性啊……
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9楼2012-03-07 10:18:47
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小星丹925

木虫 (著名写手)
★
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你们懂得都好多啊 不知道我什么时候能弄明白这些分子的东西~~~
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10楼2012-03-07 18:20:24
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 冰凝东 at 2012-03-07 10:18:47:
是的！！挑单克隆于相应抗性的液体培养基中，如果是1.5ml的我一般是震荡培养2-4个小时后以菌液为模板进行PCR检测，PCR体系跟你之前用的完全一样，只是模板加的是新鲜菌液。之后凝胶电泳检测，有目的条带的则进行 ...

谢谢你的回复，你们在做转化连接时间是怎么安排的。我一般第一天晚上做连接，16度到第二天晚上再做转化，这样第三天晚上才能挑单克隆，感觉时间周期很长。你们时间一般是怎么安排的，有什么好的建议没。谢谢
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11楼2012-03-08 09:37:57
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冰凝东

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
如果是T4连接酶，目的基因和载体的连接，我一般也是连接过夜，第二天下午或晚上转化涂板，第三天挑单克隆的……以前也有早晨早起转化，当天晚上挑单克隆的……
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12楼2012-03-09 16:16:19
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xingxing8713

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我想知道，你的菌是多少，提不出质粒。质粒很好提，怎么会提不出呢
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13楼2012-03-10 11:11:21
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xiaodao1

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
其实可以直接用菌落PCR，那样子似乎比菌液PCR更节约时间
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14楼2012-03-10 17:30:47
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