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shjdyb

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于药物体外二相代谢研究

求助:我现在在做一种药物的体外代谢研究,体内以证明其代谢产物是葡糖醛酸结合和硫酸结合代谢产物,现在在做体外实验,一直做不出代谢现象,请求大家帮助。

我的孵育体系是100μL:按文献方法葡糖醛酸体系:微粒体0.1mg/mL, 5mM Mgcl2, 0.03%曲拉通,0.5mM药物,孵育5min后,3mMUDPGA启动反应,孵育60min.
硫酸体系是使用的肝胞质液,其他条件同上(未加曲拉通),PAPS启动反应。
     实验非常着急,谢谢大家的帮助。
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taxue314

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by mc0326 at 2012-03-06 15:35:28
有几个可能的问题,你试一下
首先是做葡萄糖醛酸结合实验需要加穿孔剂阿拉霉素,否则底物很难和UGT接触,影响实验效果。sigma可买,内附说明书。你们加的那个曲拉通不知道是不是这么作用。
其次是微粒体蛋白浓度是 ...

能告诉我你们用的7-羟基香豆素做阳性对照检测的色谱条件是什么吗,代谢产物大概保留时间是多少,我做的检测不到,急!谢谢
12楼2015-04-03 13:25:22
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mc0326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
karl2100(金币+1): 谢谢! 2012-03-11 00:08:32
有几个可能的问题,你试一下
首先是做葡萄糖醛酸结合实验需要加穿孔剂阿拉霉素,否则底物很难和UGT接触,影响实验效果。sigma可买,内附说明书。你们加的那个曲拉通不知道是不是这么作用。
其次是微粒体蛋白浓度是不是有些低,我们用的是0.5 mg/mL的
第三,仅用氯化镁就可以了吗,我们用的是PBS
最后,建议一下,可以先用容易发生葡萄糖醛酸结合的化合物验证一下实验体系,我们用的是7-羟基香豆素
希望能帮到你
2楼2012-03-06 15:35:28
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shjdyb

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
: Originally posted by mc0326 at 2012-03-06 15:35:28:
有几个可能的问题,你试一下
首先是做葡萄糖醛酸结合实验需要加穿孔剂阿拉霉素,否则底物很难和UGT接触,影响实验效果。sigma可买,内附说明书。你们加的那个曲拉通不知道是不是这么作用。
其次是微粒体蛋白浓度 ...

谢谢你的回答,我的微粒体浓度写错了是1mg/ml,总的体系是PBS,只是另外加了氯化镁,关于穿孔剂从文献上查的有用曲拉通的,我也做了阳性对照了用的对乙酰氨基酚,也没有代谢。微粒体活性应该没问题,做有些药物的一相代谢做出结果了。想问一下,你们做体外代谢实验时有没有发现哪个步骤的影响因素比较大啊。试了一个多月了都没有结果,真的很着急,非常感谢你的帮助。
3楼2012-03-10 23:08:05
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mc0326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


shjdyb(金币+1): ★★★很有帮助 2012-03-11 10:17:22
我们之前也试过对乙酰氨基酚做阳性对照,发现它保留时间特别早,不太好测定,结果不是很明显,才换了7-羟基香豆素。还有,我记得对乙酰氨基酚应该是要先I相代谢加羟基后才能再加葡萄糖醛酸吧,需要加NADPH的
4楼2012-03-10 23:25:11
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