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吉林农大

木虫 (小有名气)

[交流] 如何在蛋白纯化后去除6组氨酸(6His)标签 已有13人参与

为了对表达的蛋白进行后期纯化,就连入了相应的6组氨酸标签,这个标签与蛋白之间是如何接合的呢(Linker还是直接融合),接合后在蛋白过柱纯化时,又是如何得到没有6组氨酸标签的目的蛋白呢!这些问题,大家是怎么考虑的呢!
因为有的时候表达一种蛋白是要考虑到其空间构象的变化的,所以在表达成功后,一定要去除上面本来没有的东东,标签就是一个例子!

[ Last edited by 吉林农大 on 2012-2-23 at 01:11 ]
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我靠
1楼 2012-02-23 01:10:03
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
6组氨酸标签与目的蛋白的基因之间构建酶切位点，比如凝血酶的酶切位点，在用Ni-NTA树脂螯合目的蛋白质后不用咪唑洗，而直接用凝血酶（thrombin）加缓冲溶液切割6组氨酸标签与目的蛋白的酶切位点，这样洗脱下来的就是没有6组氨酸标签的目的蛋白质。凝血酶（thrombin）的酶切位点：基因工程表达系统中融合蛋白常用的连接序列，凝血酶处理可将融合蛋白中目的蛋白与非目的蛋白的肽段分离，最适切割位点是：P4-P3-P2-Arg↓-P1′-P2′，式中P4和P3为疏水氨基酸，P1′和P2′为非酸性氨基酸，↓为切割位点。
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13楼2013-06-27 23:50:32
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
组氨酸标签对空间结构影响一般较小，所以一般采用直接融合。
在标签与蛋白之间加上蛋白酶酶切位点，比如肠激酶酶切位点，纯化后用蛋白酶酶切除去组氨酸标签。
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2楼2012-02-23 07:46:00
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一毫升的枪

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
小丹木木(金币+1): 鼓励 2012-02-23 10:06:11
有些载体，例如pet28a上面就带有His标签的，你如果用载体带的标签，中间的那段linker上有thrombin 的酶切位点，可以表达纯化后切掉
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4楼2012-02-23 10:01:54
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馋猫

银虫 (小有名气)
★
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小丹木木(金币+1): 鼓励 2012-02-23 13:51:44
很多载体是有酶切位点的，除了一些特殊的蛋白不能用his，大多数都没影响
如果你要切掉his的话，推荐不要用带有his 的载体
不如直接换gst，mbp之类的载体，纯化效率更高，纯化之后酶切掉tag
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5楼2012-02-23 10:43:30
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