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adili

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-27 08:33:48
xiaoyang123: 金币+3, ★有帮助 2012-04-28 12:43:05
引用回帖:
10楼: Originally posted by 137167741 at 2012-03-02 10:39:02:
一般的引物的注意点，都必须注意，此外，还有要跨内含子设计，片段长度不能太长大概100~200bp即可，等等

实时荧光有两种方法，一种是染料法，一种是探针法。染料法只需设计引物而探针法则需设计引物外还得设计一条探针。
引物的设计
引物要尽量满足以下要求：1）引物长度一般为18-21bp，且上下游引物的长度差别不要大于3bp.过长或过短都不合适。然而在进行长片段PCR扩增时，为避免非特异性的扩增的影响，往往又需要增加引物的长度，一般要在30bp以上。2）由于进行PCR扩增时，在DNA聚合酶作用下，将沿着引物3’端进行延伸，所以3’端的几个碱基对PCR反应的成功与否具有重要意义，它们应当与模板严格配对。引物3’最末端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而另外三种碱基的错误引发效率相对小一些；而且这一碱基最好不要落在密码子的第三位碱基上，因为这一碱基位点较其它位点具有更高的变异性。3）引物的GC含量一般为45%-55%，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。4）引物所对应的模板序列的Tm值最好在720左右，当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。两个引物的Tm值相差不能大于5oC 5）△G值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标。一般情况下，最好不要超过9（△G为负值，这里取绝对值），以利于正确引发反应。尽量避免非特异性结合位点的存在，以避免非特异性扩增条带的出现。6）注意引物序列内部的重复和自身互补序列，不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在。否则会形成发夹结构。避免上下游引物的互补性，以免形成引物二聚体，在结果中产生引物二聚体条带。甚至降低引物的浓度，导致PCR不能正常进行反应。引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5。（7）扩增片段100-250 bp
探针的设计：
探针Tm必须比引物的Tm值高出8-10℃，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针。
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11楼2012-04-25 16:26:21
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adili

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 应助指数+1, 鼓励应助 2012-04-27 08:34:33
荧光的引物要求的纯度要高一点，产物片段不能太长！引物要尽量满足以下要求：1）引物长度一般为18-21bp，且上下游引物的长度差别不要大于3bp.过长或过短都不合适。然而在进行长片段PCR扩增时，为避免非特异性的扩增的影响，往往又需要增加引物的长度，一般要在30bp 以上。2）由于进行PCR扩增时，在DNA聚合酶作用下，将沿着引物3’端进行延伸，所以3’端的几个碱基对PCR反应的成功与否具有重要意义，它们应当与模板严格配对。引物3’最末端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而另外三种碱基的错误引发效率相对小一些；而且这一碱基最好不要落在密码子的第三位碱基上，因为这一碱基位点较其它位点具有更高的变异性。3）引物的GC含量一般为45%-55%，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。4）引物所对应的模板序列的Tm值最好在720左右，当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。两个引物的Tm值相差不能大于5oC 5）△G值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标。一般情况下，最好不要超过9（△G为负值，这里取绝对值），以利于正确引发反应。尽量避免非特异性结合位点的存在，以避免非特异性扩增条带的出现。6）注意引物序列内部的重复和自身互补序列，不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在。否则会形成发夹结构。避免上下游引物的互补性，以免形成引物二聚体，在结果中产生引物二聚体条带。甚至降低引物的浓度，导致PCR不能正常进行反应。引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5。（7）扩增片段100-250 bp
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12楼2012-04-26 19:52:02
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