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xiaoyang123金虫 (小有名气)
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[求助]
realtimePCR引物
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| 想设计realtimePCR的引物，不知realtime PCR的引物和普通PCR的引物有何区别，片段大小是否有特殊要求呢？ |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-27 08:33:48
xiaoyang123: 金币+3, ★有帮助 2012-04-28 12:43:05
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xiaoyang123: 金币+3, ★有帮助 2012-04-28 12:43:05
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实时荧光有两种方法，一种是染料法，一种是探针法。染料法只需设计引物而探针法则需设计引物外还得设计一条探针。 引物的设计 引物要尽量满足以下要求：1）引物长度一般为18-21bp，且上下游引物的长度差别不要大于3bp.过长或过短都不合适。然而在进行长片段PCR扩增时，为避免非特异性的扩增的影响，往往又需要增加引物的长度，一般要在30bp以上。2）由于进行PCR扩增时，在DNA聚合酶作用下，将沿着引物3’端进行延伸，所以3’端的几个碱基对PCR反应的成功与否具有重要意义，它们应当与模板严格配对。引物3’最末端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而另外三种碱基的错误引发效率相对小一些；而且这一碱基最好不要落在密码子的第三位碱基上，因为这一碱基位点较其它位点具有更高的变异性。3）引物的GC含量一般为45%-55%，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。4）引物所对应的模板序列的Tm值最好在720左右，当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。两个引物的Tm值相差不能大于5oC 5）△G值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标。一般情况下，最好不要超过9（△G为负值，这里取绝对值），以利于正确引发反应。尽量避免非特异性结合位点的存在，以避免非特异性扩增条带的出现。6）注意引物序列内部的重复和自身互补序列，不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在。否则会形成发夹结构。避免上下游引物的互补性，以免形成引物二聚体，在结果中产生引物二聚体条带。甚至降低引物的浓度，导致PCR不能正常进行反应。引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5。（7）扩增片段100-250 bp 探针的设计： 探针Tm必须比引物的Tm值高出8-10℃，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针。 |
11楼2012-04-25 16:26:21
2楼2012-01-04 16:20:59
shaquila
金虫 (正式写手)
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3楼2012-01-04 18:48:50
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