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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 虫子们有谁做过TA克隆呀？额想知道TA克隆的具体的实验步骤
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-12-30 23:13:24:
小事一桩，不必了啊

有钱人就是不一样啊
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好孩子！
11楼2011-12-31 03:53:53
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qiyaocheng

木虫 (小有名气)

老虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+3): Good! 2011-12-31 13:37:55
zhang8826857(金币+5): ★★★很有帮助 多谢多谢啊，你应该做过TA克隆吧？ 2011-12-31 22:45:46
有几点体会希望能帮到你
1.获得DNA片段时注意其保真性，通过片段大小选择合适的扩增酶类型。通过PCR获得片段的时候要注意保真性酶的选择，有的酶如PFU需要自己加A尾巴的，不然就连不上18T载体。
2.通过公式计算一下连接体系，调整片段与载体的合适浓度比例。
3.根据连接酶的具体性质来连接，有的连接酶是16度，有的是22度活性最高。不要连太久时间，不然会出现解释不了的事情。哈哈
4.连好之后一定要测序哦，我就曾经被高度同源的序列坑了，悲催的两个月就毁了。
加油
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毕业回望科研路，满目疮痍一身土
12楼2011-12-31 10:24:32
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by qiyaocheng at 2011-12-31 10:24:32:
有几点体会希望能帮到你
1.获得DNA片段时注意其保真性，通过片段大小选择合适的扩增酶类型。通过PCR获得片段的时候要注意保真性酶的选择，有的酶如PFU需要自己加A尾巴的，不然就连不上18T载体。
2.通过公式计算 ...

我需要将一些PCR产物链接到pMD18T载体上，可是PCR产物是干粉，是别人帮我弄的，总共有3管，老师让我先拿一管做做试试，可是一管里有PCR产物的量不知道，该怎么溶解或稀释这一管额也不知道，能否再告诉额一些东西呀？
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好孩子！
13楼2011-12-31 22:56:07
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小丹木木

荣誉版主 (著名写手)
★ ★
西瓜(金币+2): 热心斑斑哦~ 2012-01-02 17:39:28
引用回帖:
13楼: Originally posted by zhang8826857 at 2011-12-31 22:56:07:
我需要将一些PCR产物链接到pMD18T载体上，可是PCR产物是干粉，是别人帮我弄的，总共有3管，老师让我先拿一管做做试试，可是一管里有PCR产物的量不知道，该怎么溶解或稀释这一管额也不知道，能否再告诉额一些东西 ...

不知道确定的量的话，可直接加500微升的无菌水或者TE，看着较多加1毫升也可以，影响不会太大的，以前就这么做过的，好像没什么问题，你可以试试
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14楼2012-01-02 12:26:13
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857(金币+3): ★★★很有帮助 2012-01-03 11:26:56
zhang8826857(金币+1): ★有帮助 那稀释到什么浓度比较合适呀？ 2012-01-03 11:28:28
引用回帖:
13楼: Originally posted by zhang8826857 at 2011-12-31 22:56:07:
我需要将一些PCR产物链接到pMD18T载体上，可是PCR产物是干粉，是别人帮我弄的，总共有3管，老师让我先拿一管做做试试，可是一管里有PCR产物的量不知道，该怎么溶解或稀释这一管额也不知道，能否再告诉额一些东西 ...

不确定浓度就先用小体积无菌水溶解吧。按照稀释引物的办法，先短暂离心把粉末离下去，然后加50 uL无菌水（体积自己看着办哈），涡旋振荡一下，再短暂离心把液体收集到管底，然后再用分光光度计测下浓度。
太浓了可以稀释，太稀的话就麻烦些，无水乙醇沉淀或者用PCR产物回收试剂盒再回收。
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15楼2012-01-02 17:42:42
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qiyaocheng

木虫 (小有名气)

老虫

【答案】应助回帖

★
小丹木木(金币+1): 鼓励应助哦 2012-01-03 10:04:33
同意楼上，先稀释，用微量5ul测定一下OD值，换算成DNA的浓度，然后，根据你的片段长度，计算连接体系
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毕业回望科研路，满目疮痍一身土
16楼2012-01-03 09:51:03
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小丹木木

荣誉版主 (著名写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-02 17:42:42:
不确定浓度就先用小体积无菌水溶解吧。按照稀释引物的办法，先短暂离心把粉末离下去，然后加50 uL无菌水（体积自己看着办哈），涡旋振荡一下，再短暂离心把液体收集到管底，然后再用分光光度计测下浓度。
太浓了 ...

还是你们做实验细致啊，像我这样好像太马虎了啊
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17楼2012-01-03 10:05:56
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wx1119 at 2011-12-30 23:09:27:
你的DNA样品是什么？

就是一段DNA序列啊，干粉的，我就是想把这段DNA序列连接到载体上
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好孩子！
18楼2012-01-03 11:26:29
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

zhang8826857(金币+4): ★★★很有帮助 2012-01-03 18:37:50
引用回帖:
17楼: Originally posted by 小丹木木 at 2012-01-03 10:05:56:
还是你们做实验细致啊，像我这样好像太马虎了啊

呵呵，共同学习，不用客气的

回楼主：一般最后稀释到100~300 ng/uL都可以，然后按照kit的说明书，用一定量的载体和PCR产物去连接就可以了。
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19楼2012-01-03 16:16:45
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wx1119

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by zhang8826857 at 2012-01-03 11:26:29:
就是一段DNA序列啊，干粉的，我就是想把这段DNA序列连接到载体上

我的意思是你的样品是细菌的吗？ 细菌的话，我敢保证手提就很好，我用盒子提，量就没有手提多，就是时间比较长。
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20楼2012-01-03 22:21:59
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