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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pe194质粒中温敏复制子的克隆与基因敲除用穿梭质粒的构建问题
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光

木虫 (小有名气)

[求助] pe194质粒中温敏复制子的克隆与基因敲除用穿梭质粒的构建问题

文献报道芽孢杆菌用质粒pe194中含有一个我很感兴趣的温敏复制子，可用于基因敲除用。我现在有一个穿梭质粒能够在大肠杆菌与芽孢杆菌中复制表达，但该质粒中的芽孢杆菌用复制子不符合实验要求，想替换成上述的pe194中温敏复制子。   
   本人没有pe194，目前从另一个质粒中已获得该温敏复制子的全长片段，约1.3kb左右，双酶切验证已正向插入到我自己的穿梭质粒中。
   我的这个构建好的穿梭质粒拥有大肠杆菌用氨苄抗性和芽孢杆菌用卡那抗性，两个抗性基因均能在大肠杆菌中表达。但电转化进入芽孢杆菌中，却没有任何转化子在28度下长出。不知道为什么？转化条件我可以自己摸索，但就担心质粒构建过程中出现问题。
   有做过这方面实验的同学吗？有pe194质粒的吗？能交换吗？呵呵
   本人没怎么做过分子生物学，实验室里也没有能帮忙的师兄师姐，小木虫里的虫虫们能否提供些建议，多谢。

[ Last edited by 光 on 2011-12-9 at 10:46 ]
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1楼 2011-12-09 10:43:51
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gandalf886

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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光(金币+2): 培养了2天，全长应该都扩出来了，我再试试吧，多谢 2011-12-11 11:10:31
28度可能就是长得慢吧，可能得长两三天。你把pE194复制区扩全了吗，包括复制起点和复制蛋白编码区。
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2楼2011-12-10 16:53:10
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