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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重叠延伸；配对碱基数目
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grape114

金虫 (正式写手)

Biosimilars

[求助] 重叠延伸；配对碱基数目

我的东西小，没用模板，想直接两个引物重叠延伸pcr，出现个问题
现在有两个方案，一个是只重叠配对11个碱基，最后一个是重叠15个碱基但是组后3个碱基是5‘>TTA<3',然后还有一个环，现在选择哪个方案？方案一怕配对太少重叠不出来，方案2怕有环不好延伸，求指点？如果11个能重叠延伸出来最好
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笑对人生，相信自己。
1楼 2011-11-26 10:57:50
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★
amisking(金币+1): 鼓励发帖交流。 2011-11-26 18:48:03
你的东西多大？看你的设计好像不大啊，为什么不设计两个全长能互补的引物，变性后直接退火呢？
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Thank-you，so-blue.
2楼2011-11-26 11:44:11
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grape114

金虫 (正式写手)

Biosimilars
引用回帖:
2楼: Originally posted by susizheng at 2011-11-26 11:44:11:
你的东西多大？看你的设计好像不大啊，为什么不设计两个全长能互补的引物，变性后直接退火呢？

我的东西不大，不多设点互补部分是引物长度要控制在59bp啊，你懂得，我设计过13个碱基互补的，不过那个最后一个是T,从倒数第二个开始就形成环了，pcr效果不好，所以这次改进下，两个方案，互补11个碱基，引物环少，能量低，但配对少啊，15个碱基互补的，也行，但是倒数第四个开始就有个环，最后三个还是TTA，我不知道选用那个啊？
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笑对人生，相信自己。
3楼2011-11-26 13:02:23
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感觉楼主说的好乱啊，我也正在做重叠延伸PCR，重叠部分在11与13之间的差别不会很大，掌握好退火温度就好，最好做个梯度寻找做合适的条件。你得根据引物结合的亲和能与成环的亲和能的相对大小来判断。
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
4楼2011-11-26 13:39:34
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grape114

金虫 (正式写手)

Biosimilars
引用回帖:
4楼: Originally posted by imyting at 2011-11-26 13:39:34:
感觉楼主说的好乱啊，我也正在做重叠延伸PCR，重叠部分在11与13之间的差别不会很大，掌握好退火温度就好，最好做个梯度寻找做合适的条件。你得根据引物结合的亲和能与成环的亲和能的相对大小来判断。

你的意思是重叠部分13个或者11个影响不大是吧?我看有的说最后别低于15个。还有成环的亲和能怎么看？我只能查出引物结合部分的退火温度
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笑对人生，相信自己。
5楼2011-11-26 14:53:59
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+4): 鼓励应助！热心！ 2011-11-26 20:31:50
grape114(金币+1): 指出重点 2011-11-27 10:19:31
找出结合部位，用引物设计软件计算，比如prime 5等，重叠部分没那么严格，只要退火温度合适七八个重叠都能连起来
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
6楼2011-11-26 17:05:58
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xuwei119

新虫 (初入文坛)
做过12、13个的没问题，最好别低于15个那只是理论，就像不要三个连续的C，其实真做的时候没那么严格
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7楼2011-11-30 15:15:14
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