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免疫荧光技术
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一、一些基本概念和基本知识： 1 荧光免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。 2.技术分类： ⑴荧光抗体技术(荧光显微镜技术) 抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判 定结果的检测方法。 ⑵ 免疫荧光测定技术： 抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定 荧光强度而推算被测物浓度的检测方法 3.荧光的产生： 物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。 这种物质，称为荧光素 由光激发所引起的荧光，为光致荧光 ------荧光免疫技术 由化学反应所引起的荧光，为化学荧光 ------化学发光技术 4.荧光素的荧光特性： ⑴ 停止供能，荧光现象随即终止 ⑵ 对光的吸收和荧光的发射具高度选择性 入射光波长<发射光波长 ⑶ 荧光效率： 发射荧光的光量子数 荧光效率=------------------------------- 吸收光的光量子数 ⑷ 荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱 5.常见荧光素： ⑴ FITC ⑵ RB200 ⑶ TRITC ⑷ 镧系：Eu、Tb ⑸ PE ⑹ 其它 常见荧光素的特性： ⑴ FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm， 发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。 ⑵ RB200： 橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光 595~600nm，橘红色荧光。 ⑶ TRITC： 紫红色粉末，吸收550nm，发射光 620nm，橙红色荧光。 ⑷ 镧系：Eu、Tb ⑸ PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色 荧光。 ⑹ 其它：酶作用后产生荧光物质。 酶作用后产生荧光物质： 酶 底物 产物 激发光 发射光 Β-G MUG MU 360 450 AP MUP MU 360 450 HRP HPA 二聚体 317 414 6.合适荧光素的选择 ⑴ 具有与蛋白质形成共价键的化学基团。 荧光素-N=C +NH-蛋白质 荧光素-N-C-N-蛋白质 ‖ ︱ ︱‖ ︱ S H H S H ⑵ 荧光效率高，标记后下降不明显。 ⑶ 荧光色泽与背景色泽对比鲜明。 ⑷ 标记后能保持生物学活性和免疫活性 ⑸ 标记方法简单、快速。 ⑹ 安全无毒 二、 荧光抗体的制备 1 荧光素与抗体结合（标记） 2 荧光抗体的纯化 3 荧光抗体的鉴定 1.荧光素与抗体结合方法： ⑴ 透析法：①适用于蛋白质含量低、样品体 积小的抗体溶液的标记 ②标记较均匀，非特异荧光较低 ⑵ 搅拌法：①适用于蛋白质含量较高、样品 体积较大的抗体溶液的标记 ②标记时间短、效率较高，荧光 素用量节省 ③影响因素多，非特异荧光较强 **透析法 第一步： 将含10mg/ml的Ig溶液10ml 装入透析袋。 第二步： 将上述透析袋放入烧杯中 ： 含0.1mg/ml FITC的 pH=9.4的碳酸盐缓冲液100ml。 第三步： 4℃磁力搅拌24h。 第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴定 **搅拌法 第一步： 将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。 第二步： 加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml 第三步： 25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶液 第四步： 25℃下搅拌1h，4℃下继续搅拌 4h，然后进行纯化、鉴定 2. 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质 ***** (1)除去未结合荧光素： A 透析法： 将标记后的抗体溶液装于透析袋，于流动的自来水中透析约10min，然后移入pH=7.4的磷酸盐缓冲 液中，在4℃下透析，直至透析外液在紫外灯下不呈现荧光为止。 B 凝胶过滤法： 葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的0.01%PBS溶胀后装柱，加入标记后的抗体溶液，然后用上述PBS洗脱，取洗脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀后，上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml. (2)除去标记不适当的抗体： 采用DEAE纤维素离子柱。将DEAE纤维素用pH=7.6的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡装柱，加入标记抗体溶液，进行分步洗脱。 未结合荧光素的抗体，所帶负电少，最先洗出。 过量结合荧光素的抗体，所帶负电多，最后洗出。 (3)除去非特异反应物质： 将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织的组织粉预先吸收。 按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在用50mg/ml比例重复一次。 3. 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法 ⑵ 结合比率(F/P)测定： 分光光度法，并按下式计算： FITC: F/P=2.87×A495/(A280-0.35×A495) RB和TRITC: F/P= A515 / A280 * F/P值高则抗体分子结合的荧光素多。 * 固定标本染色以F/P=1.5左右为宜 * 活细胞染色以F/P=2.4左右为宜 三.荧光抗体技术： ㈠抗原片的制作 ㈡试验类型 ㈢荧光显微镜检查 ㈠抗原片的制作 1 制作： *临床常见的标本有组织、细胞细菌三大类。 *可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。 *细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗原片。 2 标本的固定： ⑴ 固定目的 *防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。 *去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。 *易于保存。 *（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用活细胞染色）。 ⑵ 常用的固定方法： 抗原 固定剂 固定方法 蛋白质 95%乙醇 室温3~10min或4℃30min Ig类 甲醇 同上 酶类 丙酮 同上 激素 CCl4 同上 类脂质 10%福尔马林 室温3~10min 多糖(细菌) 10%福尔马林 室温3~10min或4℃30min 丙酮、甲醇 病毒 无水乙醇 室温5~10min或4℃30~60min 丙酮、CCl4 或-20 ℃60min以上 ㈡试验类型 1 直接法 2间接法 3补体结合法 三、其它免疫荧光技术 流式细胞仪 时间分辨免疫荧光技术 荧光偏振免疫分析技术 时间分辨荧光免疫测定 (time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA) 基本原理是：利用具有双功能基团结构的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测物含量。 时间分辨荧光测定的特点： 1 采用脉冲光源(每秒闪烁1000次以上的氙灯), 照射样品后即暂短熄灭. 2 以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧 光衰退后，再测镧系荧光。 3 镧元素具有较长的荧光寿命(105ns)，延缓测量时 间，能有效地消除非特异本底荧光(10ns)的干扰， 4 镧系螯合物的激发光与荧光发射峰之间的波长差 异(即较大的Stokes位移），有利于排除非特异性 荧光干扰，提高检测特异性。镧系元素有Eu、Sm Tb、Nd 和Dy等，其中以Eu最为常用。 5 测定技术类型有：竞争法、夹心法、间接法等。 荧光偏振免疫分析技术（fluorescence polarization immunoassay,FPIA）是利用荧光素经单一波长的偏振光照射后吸收光能，释放出相应的偏振荧光，荧光偏振程度与荧光分子大小成正比的关系而建立的免疫分析技术；技术类型主要采用竞争法。 |
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