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专业: 免疫生物学

[交流] 免疫荧光技术

一、一些基本概念和基本知识：

1 荧光免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。
2.技术分类：
  ⑴荧光抗体技术(荧光显微镜技术)
   抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判
   定结果的检测方法。

  ⑵ 免疫荧光测定技术：
   抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定
荧光强度而推算被测物浓度的检测方法
3.荧光的产生：
      物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。
      这种物质，称为荧光素
   由光激发所引起的荧光，为光致荧光
                        ------荧光免疫技术
   由化学反应所引起的荧光，为化学荧光
                        ------化学发光技术
4.荧光素的荧光特性：

⑴ 停止供能，荧光现象随即终止
⑵ 对光的吸收和荧光的发射具高度选择性
   入射光波长<发射光波长
⑶ 荧光效率：          发射荧光的光量子数
      荧光效率=-------------------------------
                        吸收光的光量子数
  ⑷ 荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱
5.常见荧光素：

  ⑴ FITC
  ⑵ RB200
  ⑶ TRITC
  ⑷ 镧系：Eu、Tb
  ⑸ PE
  ⑹ 其它
常见荧光素的特性：
  ⑴ FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，
      发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。
  ⑵ RB200：橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光
               595~600nm，橘红色荧光。
  ⑶ TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光
               620nm，橙红色荧光。
  ⑷ 镧系：Eu、Tb
  ⑸ PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色
            荧光。
  ⑹ 其它：酶作用后产生荧光物质。
酶作用后产生荧光物质：
酶    底物    产物    激发光发射光
Β-G    MUG    MU    360       450
AP    MUP    MU    360       450
HRP HPA    二聚体    317    414
6.合适荧光素的选择
  ⑴ 具有与蛋白质形成共价键的化学基团。
荧光素-N=C +NH-蛋白质    荧光素-N-C-N-蛋白质
               ‖ ︱                      ︱‖ ︱
               S H                         H S H
  ⑵ 荧光效率高，标记后下降不明显。
  ⑶ 荧光色泽与背景色泽对比鲜明。
  ⑷ 标记后能保持生物学活性和免疫活性
  ⑸ 标记方法简单、快速。
  ⑹ 安全无毒
二、荧光抗体的制备

  1 荧光素与抗体结合（标记）
  2 荧光抗体的纯化
  3 荧光抗体的鉴定

1.荧光素与抗体结合方法：
⑴ 透析法：①适用于蛋白质含量低、样品体
                  积小的抗体溶液的标记
            ②标记较均匀，非特异荧光较低

⑵ 搅拌法：①适用于蛋白质含量较高、样品
                  体积较大的抗体溶液的标记
            ②标记时间短、效率较高，荧光
                  素用量节省
            ③影响因素多，非特异荧光较强
**透析法

第一步：将含10mg/ml的Ig溶液10ml
            装入透析袋。
第二步：将上述透析袋放入烧杯中：
            含0.1mg/ml FITC的
            pH=9.4的碳酸盐缓冲液100ml。
第三步： 4℃磁力搅拌24h。
第四步：取出透析袋，进行纯化、鉴定

**搅拌法

第一步：将含40mg/ml BP 溶液5ml
            装入反应瓶中。
第二步：加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐
            缓冲液4ml
  第三步： 25℃磁力搅拌下，逐滴加入
            1ml含2mg的FITC溶液
第四步： 25℃下搅拌1h，4℃下继续搅拌
         4h，然后进行纯化、鉴定
2. 荧光抗体的纯化：
  ⑴ 除去未结合荧光素
  ⑵ 除去标记不适当的抗体
  ⑶ 除去非特异反应物质

  *****
(1)除去未结合荧光素：

  A 透析法：
  将标记后的抗体溶液装于透析袋，于流动的自来水中透析约10min，然后移入pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，在4℃下透析，直至透析外液在紫外灯下不呈现荧光为止。
  B 凝胶过滤法：
  葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的0.01%PBS溶胀后装柱，加入标记后的抗体溶液，然后用上述PBS洗脱，取洗脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀后，上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml.

(2)除去标记不适当的抗体：
   采用DEAE纤维素离子柱。将DEAE纤维素用pH=7.6的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡装柱，加入标记抗体溶液，进行分步洗脱。
   未结合荧光素的抗体，所帶负电少，最先洗出。
   过量结合荧光素的抗体，所帶负电多，最后洗出。

(3)除去非特异反应物质：

将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织的组织粉预先吸收。
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在用50mg/ml比例重复一次。

3. 荧光抗体的鉴定：
⑴ 抗体含量测定：双扩法

⑵ 结合比率(F/P)测定：
   分光光度法，并按下式计算：
   FITC: F/P=2.87×A495/(A280-0.35×A495)
   RB和TRITC:    F/P= A515 / A280
   * F/P值高则抗体分子结合的荧光素多。
* 固定标本染色以F/P=1.5左右为宜
* 活细胞染色以F/P=2.4左右为宜
三.荧光抗体技术：

   ㈠抗原片的制作
   ㈡试验类型
   ㈢荧光显微镜检查
  ㈠抗原片的制作
  1 制作：
*临床常见的标本有组织、细胞细菌三大类。

*可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。
*细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗原片。
2 标本的固定：
⑴ 固定目的
*防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
*去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
*易于保存。
*（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
   抗原          固定剂             固定方法
蛋白质       95%乙醇          室温3~10min或4℃30min
      Ig类          甲醇                同上
   酶类          丙酮                同上
   激素          CCl4                         同上
   类脂质       10%福尔马林          室温3~10min
      多糖(细菌)       10%福尔马林    室温3~10min或4℃30min
                        丙酮、甲醇
   病毒          无水乙醇       室温5~10min或4℃30~60min
                        丙酮、CCl4          或-20 ℃60min以上

㈡试验类型
   1 直接法

2间接法

3补体结合法

三、其它免疫荧光技术
流式细胞仪
时间分辨免疫荧光技术
荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
基本原理是：利用具有双功能基团结构的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测物含量。

时间分辨荧光测定的特点：
1 采用脉冲光源(每秒闪烁1000次以上的氙灯),
照射样品后即暂短熄灭.
   2 以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧
光衰退后，再测镧系荧光。
3 镧元素具有较长的荧光寿命(105ns)，延缓测量时
   间，能有效地消除非特异本底荧光(10ns)的干扰，
4 镧系螯合物的激发光与荧光发射峰之间的波长差
   异(即较大的Stokes位移），有利于排除非特异性
   荧光干扰，提高检测特异性。镧系元素有Eu、Sm
      Tb、Nd 和Dy等，其中以Eu最为常用。
5 测定技术类型有：竞争法、夹心法、间接法等。

荧光偏振免疫分析技术（fluorescence polarization immunoassay,FPIA）是利用荧光素经单一波长的偏振光照射后吸收光能，释放出相应的偏振荧光，荧光偏振程度与荧光分子大小成正比的关系而建立的免疫分析技术；技术类型主要采用竞争法。

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