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guoting329银虫 (小有名气)
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连接转化
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载体用的3300.片段大小1800bp,16°过夜连接，在卡那抗性的板上长出来了，但摇 菌怎么都摇不起来，摇菌用的是卡那抗性的LB液体培养基，难道板上长的全部都是假阳性嘛？是什么原因造成的呢？？哪位大侠能帮忙解释下，谢谢！！！ [ 来自科研家族 海外留学 ] |
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 【分子生物】EPI帖 |
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anlewo7777
木虫 (正式写手)
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2楼2011-08-30 13:06:13
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-08-30 15:27:44
guoting329(金币+5): 很好 2011-08-30 16:52:17
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-08-30 15:27:44
guoting329(金币+5): 很好 2011-08-30 16:52:17
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1：你的载体上有无筛选标记，比如说LacZ等，如果有的话可以借助筛选标记完成你的克隆； 2：固体板子上长出来，在液体里要不出来原因可能： 2.1：液体LB一般比固体敏感一些，所以用Kan浓度应该比固体稍微低一些，当然了，你如果用相同浓度也可以，但是如果不长，并不一定是假阳性，有可能是液体中浓度过大导致长不起来，这时候就需要降低液体中的抗生素浓度； 2.2 ：假阳性 2.3：其实你可以挑取长出来的单克隆划线在相同浓度的抗生素板子上，然后PCR，提取质粒验证。。。当然了你选择菌液PCR也可以的； 3：你连接过程中有问题，当然了从以下几方面改进： 3.1：载体和基因双酶切是否完全？纯化呢？ 3.2：载体和基因纯化完之后，电泳定量，然后确定连接体系中载体和基因的添加量。。。有可能是你连接体系不太合适。 4：针对目前的情况，就是把板子上的单克隆划线在相同浓度的板子上，然后PCR验证。。。然后提取质粒酶切验证。。。 祝好运。。。。  |
3楼2011-08-30 15:19:12
guoting329
银虫 (小有名气)
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4楼2011-08-30 16:54:57
guoting329
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5楼2011-08-30 16:56:12