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guoting329

银虫 (小有名气)

[求助] 连接转化

载体用的3300.片段大小1800bp,16°过夜连接，在卡那抗性的板上长出来了，但摇 菌怎么都摇不起来，摇菌用的是卡那抗性的LB液体培养基，难道板上长的全部都是假阳性嘛？是什么原因造成的呢？？哪位大侠能帮忙解释下，谢谢！！！

[ 来自科研家族 海外留学 ]
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【分子生物】EPI帖

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1楼 2011-08-30 10:59:16
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anlewo7777

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
guoting329(金币+3): 2011-08-30 16:59:50
dhd997(金币+2): good 2011-08-30 18:42:05
你可以先提质粒看看是不是真的连进去了，然后再说，如果真的是连上了，LB里不加卡纳不是也可以得到菌吗？
否则，就再做连接了，或许你的平板里的卡纳没有有效抑制，时间长了或是怎么了
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2楼2011-08-30 13:06:13
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-08-30 15:27:44
guoting329(金币+5): 很好 2011-08-30 16:52:17
1：你的载体上有无筛选标记，比如说LacZ等，如果有的话可以借助筛选标记完成你的克隆；
2：固体板子上长出来，在液体里要不出来原因可能：
   2.1：液体LB一般比固体敏感一些，所以用Kan浓度应该比固体稍微低一些，当然了，你如果用相同浓度也可以，但是如果不长，并不一定是假阳性，有可能是液体中浓度过大导致长不起来，这时候就需要降低液体中的抗生素浓度；
   2.2 ：假阳性
   2.3：其实你可以挑取长出来的单克隆划线在相同浓度的抗生素板子上，然后PCR，提取质粒验证。。。当然了你选择菌液PCR也可以的；
3：你连接过程中有问题，当然了从以下几方面改进：
    3.1：载体和基因双酶切是否完全？纯化呢？
    3.2：载体和基因纯化完之后，电泳定量，然后确定连接体系中载体和基因的添加量。。。有可能是你连接体系不太合适。
4：针对目前的情况，就是把板子上的单克隆划线在相同浓度的板子上，然后PCR验证。。。然后提取质粒酶切验证。。。

祝好运。。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
3楼2011-08-30 15:19:12
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guoting329

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by anlewo7777 at 2011-08-30 13:06:13:
你可以先提质粒看看是不是真的连进去了，然后再说，如果真的是连上了，LB里不加卡纳不是也可以得到菌吗？
否则，就再做连接了，或许你的平板里的卡纳没有有效抑制，时间长了或是怎么了

十分感谢回复，但是菌没有摇起来，应该没办法提质粒吧，LB
里不加抗生素会长很多杂菌吧？？
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4楼2011-08-30 16:54:57
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guoting329

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-30 15:19:12:
1：你的载体上有无筛选标记，比如说LacZ等，如果有的话可以借助筛选标记完成你的克隆；
2：固体板子上长出来，在液体里要不出来原因可能：
   2.1：液体LB一般比固体敏感一些，所以用Kan浓度应该比固体稍微低一 ...

十分感谢三楼的回答，很详细啊，呵呵，帮助很大，我想应该是我的载体和片段的比例没有处理好吧！再重新连接，呵呵
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5楼2011-08-30 16:56:12
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