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lizhijiang

木虫 (著名写手)

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[资源] 生物实验常用试剂

Western blot 准备
一般准备
1．双蒸水
2．瓶子（500ml、250ml），离心管
3．tip头
4．Eppendorf管
5．滤纸，餐巾纸
6．小针筒
7．微量加样器20-50μl
8．匀浆器
二裂解液
1．配胞浆裂解液（100ml，4℃）
10mM HEPES PH7.9    238.4mg
10Mm KCL             74.5 mg
0.5mM DTT             7.7 mg (临时加，1M DTT，49.8μl)
0.2mM PMSF(有毒)    3.4 mg (临时加，100mM PMSF，195.4μl)
苯甲基磺酰氟（胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶）
0.1mM EDTA（292.2） 2.9 mg (临时加，0.5M EDTA 19.8μl)
0.1mM EGTA（380.35） 3.8 mg
配好后KOH或 NaOH定至PH7.9
（配1M DTT，1ml, 154.25mg粉剂加双蒸水至1ml）
（配100mM PMSF，1ml, 17.42mg粉剂加异丙醇至1ml）
（配0.5M EDTA，1.4615g 不含水EDTA-Na 加 8ml水，很难溶，加NaOH调PH，即易溶，定容至10ml)
（配胞浆裂解液，10ml，临时加1M DTT 4.98μl，临时加100mM PMSF 19.54μl，临时加，0.5M EDTA 1.98μl
2．配胞核裂解液，8M，尿素 20ml
9.6096g 尿素加水 20ml
三 BCA法测蛋白浓度 (新的96孔板细胞室用)
196μl，3.92μl，10μlsample（1μlsample，9μl水）
九个ependorf，编号
Volume of diluent Volume and source of BSA Final BSA Concentration
A    0       300μl of stock             2000μg/ml
B    125μl    375μl of stock             1500μg/ml
C    325μl    325μl of stock             1000μg/ml
D    175μl    175μl of vial B dilution    750 μg/ml
E    325μl    325μl of vial C dilution 500 μg/ml
F    325μl    325μl of vial E dilution 250 μg/ml
G    325μl    325μl of vial F dilution 125 μg/ml
H    400μl    100μl of vial G dilution 25 μg/ml
I       400μl       0                      0 μg/ml=blank
1 ependorf 样品编号
2 196μl“A”，3.92μl“B”，分别加入，96孔板每孔25μl标准品或样品（样品5μl，加水20μl），（样品2.5μl，加水22.5μl）混匀30秒
3       盖盖，37℃，30m
4 恢复室温，562nm读，计算（样品浓度乘5）（样品浓度乘10）
四配制溶液
1．丙烯酰胺存储液300ml
通风橱搅拌至溶解 4℃ 暗处（棕色瓶）最长一月
87.6g acrylamide丙烯酰胺(有毒，戴口罩，面罩)
2.4g 亚甲基丙烯酰胺
300ml 水
* 29.2g丙烯酰胺 0.8g亚甲基丙烯酰胺 100ml水）
2． 1.5M Tris-HCL,PH8.8，150ml，4℃
27.23g Tris base
80ml    水
慢加浓盐酸至PH8.8(约5ml) 加水至150ml
3．0.5M Tris-HCL,PH6.8，100ml，4℃
6g       Tris base
60ml    水
慢加浓盐酸至PH6.8(约3ml) 加水至100ml
4．10％SDS w/v，100ml，室温
10g    SDS(戴口罩，面罩)
加水至100ml
5． 1%溴酚蓝（w/v）(0.5％太淡)
100mg 溴酚蓝
加水至10ml搅拌
6．sample buffer样品缓冲液， 4℃
7.1ml       水
2.5ml       0.5M Tris-HCL,PH6.8
5ml       glycerol甘油(丙三醇92.09)，剪掉头
4ml       10％SDS
0.4ml       1％bromphenol blue 溴酚蓝
19ml    Total volume（1ml ependorf 管分装）
用前加50μl β-巯基乙醇至950μl sample buffer
7．10×电泳缓冲液，PH8.3，不要用酸或碱调PH，4℃
30.3g (15.15) Tris base
144g (72)       glycine甘氨酸
10g (5)       SDS
加水至1000ml（500ml）
用前稀释至1×（50ml，10×电泳缓冲液加450ml水中）
8． 10％APS
4℃    数月（隔周新鲜配置）
0.5g    ammomum persulfate 过硫酸铵(戴口罩，面罩)
5ml    水
9．TEMED，避光，4℃
四转移缓冲液
2.9g    甘氨酸 39mmol/L
5.8g    Tris base 48mmol/L
0.37g    SDS    0.037％
200ml    甲醇    20％
加水至1L（4℃）
五．染色液
1．10×丽春红存储液
2g          丽春红
30g       三氯乙酸
30g       磺基水杨酸
100ml       水
1份存储液加9份水配成使用液水（1：10稀释成使用液）
2．1×丽春红使用液
0.2g       丽春红
1ml       冰乙酸(冰醋酸)
定容 100ml
3．PBS(每次至少2L)，配PBS，1L
8g NaCL
0.2g KCL
1.44g Na2HPO4（3.628g Na2HPO4. 12H2O）
0.24g KH2 PO4
NaOH(书上是HCL，实际用NaOH)调PH至7.4，加水至1L，高压灭菌20分，保存于室温
4．封闭液（临时配5-10ml）
TBS+BSA(2%,细胞室用（2gBSA于100ml中）（0.2gBSA于10ml中,够一块用，多点无妨）
5．漂洗液（临时配）
TBS 1L加0.5g（0.5ml液体）吐温-20（质量体积浓度, 粘稠，剪掉头吸），0.05％
500ml-------0.25g-0.25ml,    250ml ---0.125 ml,
200ml---0.1ml ,                125ml -----0.0625ml
6．配一抗
A液：0.1mg + 1ml PBS （0.1mg/ml）
B液：取A液0.1ml 加PBS 0.9ml (0.01mg/ml, 10μg/ml)
取B液 0.16ml 0.16ml* 10μg/ml=1.6μg 1.6μg/8ml=0.2μg/ml
(可先加0.08ml-0.8μg-4ml封闭液)
冰上，取与膜大小相仿盒子，节约一抗及PBS；A液分装为233μl，233μl，233μl，；B液用掉0.08ml，0.08ml，0.08ml，分装为253μl(B1已用掉)，253μl（B2），253μl(B3)，
7．配二抗
8μl二抗加入8ml封闭液,1:1000(第一次7.5μl加入5ml,1:700)
4μl---4ml
胞浆蛋白提取
1       玻璃匀浆器干燥2-3h，100℃
2       80℃组织于液氮中，
取胞浆裂解液 10ml，临时加1M DTT 4.98μl，临时加100mM PMSF 19.54μl，临时加，0.5M EDTA 1.98μl
3 编号后，匀浆器于冰块中，ependorf管于冰块中，1ml裂解液于匀浆器
4 200mg组织于匀浆器中
5 冰外匀浆，否则易碎
5 冰上置15m，置ependorf管，
6 加NP-40（纯的，很稠厚）每管6μl，混匀（Tip）
7 冰上置15m
8 离心机予离心置2℃，25000转，15m
9 分装上清，200-300μl每管，置-20℃（短期保存可4℃）
10 继续核蛋白提取，加8M尿素0.5ml左右，大的tip保留，捣碎用，冰上20m
测蛋白浓度（BCA法，二喹啉甲酸）
1加样于96孔板
2测
3计算
配胶
纱布无水酒精干燥玻璃板、梳子，量玻板的宽度
（50ml 10*电泳缓冲液加450ml水中；）
在距梳齿0.5cm或距玻板1.5cm处标记(胶会收缩)
1配12％，1             5ml          4ml       8ml       12ml
         水             1.7ml    1.36    2.72    4.08
         丙烯酰胺       2ml          1.6       3.2       4.8
      1.5M Tris-HCL 1.25 ml    1       2       3
      10％SDS          50μl       40μl    80μl    120μl
      10％APS          25μl       20μl    40μl    60μl
      TEMED          2.5μl       2μl       4μl       6μl
覆盖水层1-5mm, 置30-45m,量分离胶的宽度，倒出，冲洗未聚合的丙烯酰胺，滤纸吸干（带手套，切七张滤纸，四大（4.5cm-8.3cm）三小(4.4cm-8.2cm)，切膜(4.5cm-8.3cm)
2配5％积层胶，1块，       2ml       4ml             6 ml
水             1.14ml    2.28ml          3.42 ml
丙烯酰胺       0.34 ml    0.68ml          1.02ml
0.5M Tris-HCL 0.5 ml       1 ml          1.5 ml
10％SDS       20μl       40μl          60μl
10％APS       10μl       20μl          30μl
TEMED          2μl          4μl             6μl
插梳子，置30-45m，拔梳子，冲洗未聚合的丙烯酰胺，把凝胶固定于电泳装置，加入1*电泳缓冲液，排出凝胶底部两玻板间的气泡（注射器弯90℃），不要预电泳，以免破坏缓冲系统的不连续性。
加样（冰上）
（事先算出要加的样品缓冲液）（设定PCR100℃5m，或煤气烧水煮沸）用前加50μl β-巯基乙醇至950μl sample buffer（5μl-95μl，10μl-190μl，15μl-285μl，20μl-380μl），sample buffer稀释样品（100μg总蛋白，至少50μg）至少1：2，总体积<25μl（30-45μl），约20μl（可用水试验一下），100℃5m,冲洗加样孔，加样，每加一个，水冲洗针管于餐巾纸。最外侧加等量样品缓冲液，避免边缘效应，或MARK加样孔。
电泳
正负极正确连接，80v，30-45m(1h)，染料至积层胶底部，改120v，60m(2h)
取胶（带手套，油脂阻碍蛋白转膜）
备盒子，转移液多一点，撬玻璃，浸湿一下，刮下最左边的两个加样齿做标记，玻璃作尺子，切积层胶，垫片挑下，摇，30m
电转（带手套，油脂阻碍蛋白转膜）
（纸，膜长宽均比胶小1mm）备1张膜（浸30m）摇，纱布无水酒精干燥，玻板上，一张大滤纸浸湿放于凝胶切积层胶，6张滤纸，浸湿一张放置一张，大滤纸-膜-胶-纸(试管赶气泡)，滤纸吸干，15v，30m，看电流
取膜，切硝酸纤维膜的左下角标记
丽春红
丽春红洗一次，置丽春红中摇，5-10m，水摇、冲、摇、冲，TBS漂洗数次，每次1-2m，
免疫
1．封闭液，摇1-3h或过夜，（盖）
2．弃封闭液，TBS洗膜3次，弃TBS
3．加PBS，一抗至（先1:500,1：1000-3000变异大），摇1-3h，可过夜，（盖）
4．弃一抗，漂洗液洗膜3次，每次10m，弃，（TBS洗膜3次，弃TBS）
5．加PBS，二抗至（1：1000-3000，8μl:8ml），摇1-3h，可过夜，（盖）
# 二抗：1：2000 2μl—4ml (第一次7.5μl加入5ml,1:700，2月28日)
1：4000 1μl—4ml
6．弃二抗，漂洗液洗膜3次，每次10m，弃，（TBS洗膜3次，弃TBS）
7．按膜面积0.1ml/cm2加入底物液（4.5*8.3＝37）
C液4.9ml加0.1mlB液，(3.626ml---0.074ml)
8．浸显色液2-3m(镊子夹住膜去浸，不要将底物液直接倒于膜上)，水略为漂洗，转入250PBS的托盘中
9．水冲，allow to air dry on a paper towel，日照褪去颜色
水试验分离胶，积层胶，加样孔的体积
设置对照：1 不与靶蛋白反应的抗体（免疫前血清或非相关单克隆抗体）2 样品对照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的制品
1．按膜面积0.1ml/cm2加入封闭液（4.5*8.3＝37----3.7ml），置平缓摇动床上1-2h
2．弃封闭液，立即加入封闭液和适量一抗
3．按膜面积0.1ml/cm2加入封闭液和适量一抗，置平缓摇动床上2h（非特异性结合背景是温育时间和温度的函数，延长时间和提高温度都会引起背景升高）
4．弃封闭液和抗体，250mlPBS漂3次，每次10分钟
5．经PBS最后一次漂后，将膜转至200ml 150mmol/L NaCL, 50mmol/L Tris-CL(PH7.5)溶液托盘中，平缓摇10分钟（切记在加入酶联第二试剂之前须清除膜上的叠氮钠和磷酸盐）
6．按膜面积0.1ml/cm2加入封闭液（二抗推荐1：200-1：2000，使终浓度达0.5-5μg/ml）, 置平缓摇动床上1h
7．将膜转至200ml 150mmol/L NaCL, 50mmol/L Tris-CL(PH7.5)溶液托盘中，平缓摇10分钟，重复3次，每次更新NaCL -Tris-CL
8．反应2-3分钟，（使用辣根过氧化物酶不可能完全排除背景，须十分小心观察声色反应，一倭特异染色蛋白带清晰可见，就尽快终止声色反应）水略为漂洗，转入250ml PBS的托盘中。

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