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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 切口酶用量问题
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bdchengli

木虫 (小有名气)

[求助] 切口酶用量问题

我的实验设计是在发卡结构的分子信标上设计了两个酶切位点，为什么我的切口酶用量要非常大才能出现象，是以前用量的4倍甚至更多
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1楼 2011-07-22 10:30:38
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): Good！ 2011-07-22 16:53:25
影响酶切活性的因素有许多，概略的说可分为外因和内因。外因是可预见和控制的，如反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应时间的长短等等。内因包括位点偏爱性、甲基化底物、底物的构象。构象的影响主要指切割线性 DNA 和超螺旋 DNA 时的活性，如与切割 lDNA 相比， EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ 需要至少 2.5-10 倍的酶来切割 pBR322 的超螺旋 DNA 。 PaeRTⅠ 与 XhoⅠ 切割相同的序列（C↓TCGAG），但如果 5' 端为 CT 则 PaeRTⅠ 不能切割。
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
5楼2011-07-22 12:38:35
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): 个别酶的活力定义不一样，楼主还需看说明书。 2011-07-22 12:03:36
bdchengli(金币+5): 2011-07-22 15:55:31
内切酶的一般用量是1ul酶切大约1ugDNA，当然有些时候需要加大酶的用量：
（1）如果DNA内含有多个你所要酶切的酶切位点，那么你需要加大用量（道理很简单，不用解释）
（2）双酶切时一种酶在公用buffer里面活性在80%一下
（3）经以前验证，这种酶较其他酶活性低的，一般不常用的酶（稀缺一点的）会出现这种情况
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2楼2011-07-22 10:43:13
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bdchengli

木虫 (小有名气)
我那个只用的是一种内切酶，两个切口，用量加大的有点太多了
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3楼2011-07-22 10:50:40
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zlu520

至尊木虫 (职业作家)

限制人

【答案】应助回帖

酶活可能降低了。。。
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无完人！
4楼2011-07-22 11:03:56
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