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答网友问——关于生物素标记 已有15人参与
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近日有小木虫虫友QQ询问我有关生物素标记的问题，既然已经写了一些回复，不妨贴出来大家共享吧，也可以继续讨论 问： 我要在GFP上标记BNHS，现在在便宜的BSA上试的，一篇很老的文章上将，可以用DMSO溶BNHS，估计活化的作用，用硼酸钠缓冲液（pH8.8）溶BSA，然后放一起4小时室温下，接着用NH4Cl除去多余的BNHS，就可以做透析了，我有两点不明白，BNHS和蛋白的量怎么确定，就是多少个BNHS接一个蛋白上？如果BNHS可以和蛋白上的自由氨基结合，那就是量确定不下来喽？第二个是我依稀记得我在Sigma上看到BNHS的推荐pH是6.5-8.5，我用的8.8接近9会不会影响标记效率，文中用这个值是不是还有别的考虑啊？ 答： 第一，Bio-NHS不需要用DMSO溶，也不需要活化。因为Bio-NHS本身就是已经活化过的生物素，它是可溶于水的，可以直接和蛋白上的氨基进行反应。而没有-NHS化的biotin本身是一种不能溶于水的小分子，也不能直接和氨基反应。如果买的是biotin的话，才需要将其溶解在DMSO中，在用EDC等进行活化，这个方法不推荐，新手不容易做好，你就直接买活化好的去标记就可以了。 第二，标记比例按照摩尔数计算，被标记物：Bio-NHS=1:20是最常用的比例如果要求高的话，可上下2-4倍摸索最佳标记比例。Bio-NHS和蛋白表面所有氨基有同等几率的标记机会，并不一定标记上去的越多越好，不同的蛋白依据其性质会有差异； 第三：标记PH值最好在7.4左右，8.8或9会一定程度上影响标记效率。 问： 那能帮我鉴定下我买的是活化过的么，sigma的H1759-5MG，名字叫Sigma(+)-Biotin N-hydroxysuccinimide ester ，就这一个问题了，谢谢你。 答： 是的，是活化过的，可以直接标记 问： 嗯~~有个问题，你说标记完了，为什么文献中说要加NH4Cl啊，我想着是把BNHS剩余的反应掉，可是反应不反应有什么作用呢？不反应的不能透析出去么 答： 因为NHS-biotin的-NHS可以与任何含有氨基的物质进行反应，如果不去除的话，在后续的反应中，这些过量未标记但有具有标记活性的生物素就会标记到你反应体系中有氨基的物质上，那么在检测中就会造成假阳性或者高本底。生物素这样的小分子通过透析可以去除大部分，但透析耗时长，且要保证去除的干净，就要多次换液，即使如此，可能还是会有微量的残留。但是用摩尔数超过生物素的其他含氨基的小分子去中和，一方面，耗时短，另一方面，效果会好于透析。 |
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