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libing198968

银虫 (初入文坛)

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专业: 水产生物遗传育种学

[求助] RACE实验中的 GC-Rich 问题

大家好，我刚开始做RACE的新兵，我用的是Clontech的SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit。说明书上提示说GC含量过高，不能得到预期产物，就要用Clontech 提供Advantage GC 2 Polymerase Mix (Cat. No. 639114) and PCR Kit (Cat. Nos. 639119 &639120) 来有效扩增 GC-rich模板。
我想问一下，对于植物而言，GC含量多少以上就算是GC含量过高呢？
还有就是假设预期的GC含量比较高，但真实的GC含量没有那么高，用Advantage GC 2 Polymerase Mix 来扩增会不会更加影响扩增效率呢？
求大侠指点

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生活没有彩排，所以任何时候都要好好表现，因为你没有再来一次

1楼 2011-07-19 16:33:09

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Huobol

至尊木虫 (著名写手)

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专业: 基因表达调控与表观遗传学

引用回帖:

13楼: Originally posted by fundog at 2014-04-25 20:42:53
3‘端三个碱基g为RNA, 3'末端需要做磷酸化修饰，RNAase-free-HPLC纯化...

我测序中得到的SMARTer II A Oligonucleotide
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT AC AGGGG
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT AC AGGGA
上面是不同时间做的5‘RACE，XXXXX分别为AGGGG和AGGGA，不太一样，虽然这对5‘RACE没有影响，毕竟后面的序列是5’UTR。既然你说“3‘端三个碱基g为RNA, 3'末端需要做磷酸化修饰”，看来我第一次做的AGGGG的确有3个连续的G。不知道本帖其他虫友有类似的测序结果吗？最重要的如果自己合成，该如何填写引物合成单啊是不是就写这个AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT AC AGGGG序列，末端的磷酸化修饰如何说名啊？（不能合成就算了）